1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
国内外研究概况：
可替宁（cotinine，1-甲基-5-[3-吡啶基]-2-吡咯烷酮），又称可铁宁，结构上与尼古丁（nicotine）类似，是尼古丁在人体内最主要的中间代谢产物[1]。据统计，全世界每年大约消费5.5万亿支香烟，产生大量的尼古丁，尼古丁通过主动或被动吸烟等方式进入人体后，经细胞色素氧化酶代谢，约有75-80%被转化成可替宁。可替宁化学性质稳定，在人体内的半衰期长（3~4d），是尼古丁的20倍，因此成为测量主动和被动吸烟者烟草暴露的生物标志物（biomarker）[2, 3]，多以血清、唾液中的可替宁浓度来反映吸烟状况或二手烟暴露状况。同时因可替宁的每日人均代谢量/排泄量稳定以及在污水中易于检测等特征，成为“基于污水的流行病学”检测法中检测烟草消费量的生物标志物[4]。
人体中生成的可替宁约有10-15 %来不及分解而直接随尿液排出体外并最终进入到环境水体中[1, 2]。此外，某些假单胞菌（如pseudomonassp. cs3[5]）在降解尼古丁过程中能生成可替宁。尼古丁在光或活性氧氧化时也能产生可替宁[6,7]。可替宁的沉积物/水分配系数（koc=130）、正辛醇/水分配系数（kow=0.07）和亨利系数（e=3.3×10-12 kpa）均较小[8]，具有强极性、高水溶性和不易吸附在固体颗粒物表面的特点，因此很难从水相中挥发，其污染长期存在于环境水体中[9, 10]。已有报告显示可替宁在城市污水和地表水中的检出率很高，是非常普遍污染物[4]。美国政府在2001年对全美调查中发现51％地表水样品中检测到了可替宁[11]。2007年buerge等人在瑞士中部地区的地表水样品调查发现可替宁的检出率为100%[12]。huerta-fontela等人报道2007年在西班牙东北部llobregat河饮用水水源地全年均可检测到可替宁[13]。bueno等人调查了2010年西班牙东南部henares河水中可替宁浓度为48 ng/l，而附近某污水处理厂中进口和出口的可替宁浓度高达15.4 μg/l和3.4 μg/l[14]。yao等人收集了2014年上海黄浦江沿岸的22个表层水样品和国内四个污水处理厂的污水，可替宁检出率高达100%，表层水和污水中可替宁浓度分别达到50.8 ng/l和17.5 ng/l[15]。李成等人2015年采集吉林省8个城市10个主要污水厂的进水样品，均检测到可替宁的存在[16]。由此可见，可替宁污染在环境中广泛存在。
2. 研究的基本内容和问题
可替宁污染广泛存在于环境水体中，对生态环境和人类健康有潜在威胁，开展可替宁在环境中的降解转化规律和生态毒理的相关研究非常有必要。国内外已有研究证明微生物代谢作用是可替宁降解的主要因素，本研究已分离到一株可降解代谢可替宁的菌株nocardioidessp. jq2195，并推测了部分降解途径，但是目前对可替宁微生物降解代谢过程和分子机制还不清楚。
本实验拟以可替宁降解菌株nocardioidessp. jq2195 为材料，通过降解中间产物鉴定、基因组和比较转录组/蛋白组分析、基因敲除与回补等技术，以期揭示可替宁微生物降解代谢过程和分子机理。研究成果为深入研究可替宁在环境中的降解、转化和归趋以及可能产生的生态效应提供理论依据。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
1.降解基因的异源表达和功能鉴定
将预测的各个降解基因克隆到pbbrmcs-2广宿主载体上后转化进入escherichia colidh5α中，通过三亲接合的方式导入到亲缘关系较近的但不具有可替宁降解能力的其它属菌株中（如shinellasp.hzn7）表达，来验证相应靶标底物的降解能力。
4. 研究创新点
可替宁污染广泛存在于环境水体中，对生态环境和人类健康有潜在威胁，开展可替宁在环境中的降解转化规律和生态毒理的相关研究非常有必要。国内外已有研究证明微生物代谢作用是可替宁降解的主要因素。虽然可替宁是人体和某些细菌转化尼古丁的代谢产物，但尼古丁降解菌一般不能再进一步降解可替宁。迄今为止已报道的尼古丁降解菌有30余株，这些菌株一般通过吡啶途径、吡咯途径或吡啶-吡咯结合途径降解尼古丁，而不是通过以可替宁为中间产物的降解代谢途径。这些结果预示着环境中微生物降解可替宁有着不同于尼古丁的代谢机制。
本课题实验室便成功分离到一株可降解代谢可替宁的菌株Nocardioidessp. JQ2195，并推测了其部分降解途径，同时以该菌株为材料，通过比较转录组学，利用高通量测序技术和高分辨液相质谱对总RNA进行测定，寻找差异RNA，并结合菌株Nocardioidessp. JQ2195 的基因组进行生物信息学分析，从而确定可替宁降解酶目标基因，并且鉴定可替宁降解的羟化酶，对其进行酶学特性研究，以期揭示可替宁微生物降解代谢过程和分子机理，从而获得催化可替宁代谢反应的关键酶和基因可应用于污水处理和污染环境微生物治理的工程菌株构建，并为深入研究可替宁在环境中的降解、转化和归趋以及可能产生的生态效应提供理论依据。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2020.01——2020.03 将可替宁降解关键步骤的降解酶在同缘关系较近但无相应靶标降解功能的其他菌株中进行异源表达和相关功能验证
2020.03——2020.04 进行降解关键酶的酶学特性研究，包括对靶标底物的米氏常数km和催化常数kcat等动力学参数，测定各种环境条件如温度、ph、缓冲液、金属离子、有机溶剂和各种酶抑制剂对酶活性的影响等
