1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.课题的意义
茶叶是全球三大饮料之一,也是人们温饱以后一种良好的保健和精神享受饮品。全球约有60个国家和地区种植茶叶,2016年,世界茶园面积达494.22万hm2。中国占有世界60%的茶园,其中85%左右的茶园为8000万名茶农所拥有,茶叶是这些茶农的主要经济来源。建设好茶园生态环境，从源头保证茶叶质量安全，对茶产业可持续发展、确保茶叶安全健康消费、促进茶区生态文明建设，乃至保护区域气候环境都有着重要作用[1]。覃潇敏[2]等研究表明，与单作茶树相比,茶树/大豆间作可以提高茶叶氨基酸、可溶性糖及咖啡碱含量,降低了茶多酚含量及酚氨比,有效改善了茶叶品质。间作茶树土壤的全氮、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质含量和细菌、放线菌、真菌数量均高于单作茶树,改善了土壤生态质量。同时我们发现茶树/大豆间作的大豆与单作大豆相比，间作大豆的生长速率与产量均比单作大豆要高，所以茶树与豆科植物的间作可能对两者生长都有促进作用。大豆、苜蓿和紫云英是人工种植较为广泛的三种豆科植物，本次研究以苜蓿与茶树的间作作为主要方向，将与豆科植物具有天然共生关系的根瘤菌作为具体研究对象，试通过研究茶树根系分泌物对根瘤菌结瘤基因表达的影响来探究茶树/苜蓿间作对苜蓿生长的影响。
2.国内外研究概况
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
主要通过研究茶树根系分泌物对根瘤菌结瘤基因的影响，探究茶树/苜蓿间作对这两种植物的影响
研究内容
3. 研究的方法与方案
研究方法
文献研究法、实证研究法、定量分析法、定性分析法
技术路线
实验方案
1.根系分泌物提取
1.1将茶苗全部根剪下（约20株），用清水反复冲洗后擦干水分。
1.2将茶苗根用搅拌机匀浆搅碎，加入200ml 50%乙醇，60℃回流两小时，回流得到的上清液取出离心。10000 r/min、10 min离心取上清液，圆底烧瓶中的沉淀物再加入50%乙醇，按上述步骤重复处理一次，将两次的上清液合并。
1.3旋转蒸发仪浓缩上清液至200 mL注意定量。
1.4加入等体积的石油醚，上面盖上保鲜膜，用磁力搅拌器充分混匀24小时后（12h也可以）转移到分液漏斗中，静置直至两相充分分层，取上层溶液进行旋转蒸发浓缩，浓缩挥发为粉末后样品称重，按0.2 g/mL的比例加入 DMSO，溶解后存放于-20℃备用。
1.5下层溶液加入等体积的氯仿，上面盖上保鲜膜，用磁力搅拌器充分混匀24小时后转移到分液漏斗中，静置直至两相充分分层，取下层溶液进行旋转蒸发浓缩，浓缩后样品称重，按0.2 g/mL的比例加入 DMSO，溶解后存放于-20℃备用。。
1.6下层为水相溶解物，冷冻干燥后称重，按0.2 g/mL的比例溶解于去离子水中，存放于-20℃备用。
2.基因表达载体构建
2.1目的基因片段的提取
2.1.1提取基因组
2.1.2利用PCR对目的基因片段进行扩增
PCR体系 505 （50μl）
25 μl 2x buffer
0.5/1 μl mix
1 μl 模板
1 μl DNA Polymerase
2 μl 上游引物
2 μl 下游引物
18 μl ddH2O
2.2质粒的提取
2.2.1.活菌
2.2.2 提质粒步骤
（1）取2 ml菌液，离心10000rpm 2min 弃上清，用ddH2O洗两次
（2）加100 μl溶液I ，刮板，冰浴 10 min
（3）加100 μl溶液II（现配现用），880 μl H2O 100 μl 10% SDS 20 μl 10M NaOH，轻轻转动，冰浴10 min
（4）加100 μl溶液III，轻轻转动，冰浴10 min，加2滴 氯仿，离心12000 rpm 10 min
（5）取上清，加入200 μl醋酸铵，刮板，然后离心12000 rpm 15 min
（6）取上清，加入900 μl无水乙醇，-70℃保存15-20 min，离心4℃ 12000 rpm 15 min
（7）倒去上清， 用1 ml预冷的75% 乙醇洗3遍，然后吹干，用30 μl ddH2O 重悬 4℃保存
2.3将目的基因片段插入质粒
2.3.1目的片段和质粒的酶切
反应体系
10 μl 10x buffer
5/10 μl 片段/质粒
1 μl DNA剪切酶
1 μl DNA剪切酶
ddH2O补齐至100 μl
37℃水浴
2.3.2目的片段和质粒的酶连
反应体系
2 μl 10x buffer
1 μl T4 DNALigase
6 μl ddH2O
10 μl 片段
1 μl 质粒
20℃ 过夜
2.4将质粒转化进DH5α
2.4.1转化扩培
利用电转的方法将质粒转化进DH5α，然后放入液体培养基进行扩培
2.4.2筛选验证
将扩培得到的菌液涂布在含有X-gal和链霉素的LB培养基上，进行蓝白斑筛选，培养几天后，挑选蓝色的单独菌落划平板，然后对这些菌落进行测序观察是否含有目的基因
2.4.3提取质粒
利用含有目的基因的菌落，用上述2.2的方法提取质粒
2.5将质粒转化进根瘤菌
2.5.1转化扩培
将2.4.3提取出的质粒利用电转的方法将质粒转化进根瘤菌，然后放入液体培养基进行扩培
2.5.2筛选验证
将扩培得到的菌液涂布在含有X-gal和链霉素的TY培养基上，进行蓝白斑筛选，培养几天后，挑选蓝色的单独菌落划平板进行保种
3.利用根系分泌物培养根瘤菌
3.1活化扩培
将得到的转化成功的根瘤菌接种至TY液体培养基进行扩培
3.2对照实验
将扩培得到的根瘤菌菌液吸取100 μl接种至5 ml TY液体培养基，并向培养基加入5 μl链霉素，设置验证组、阴性对照和阳性对照
（1）验证组培养基加入10 μl根系分泌物
（2）阴性对照组培养基加入10 μl的DMSO
（3）阳性对照组培养基加入10 μl的柚皮素
在28℃下进行培养，当培养基在600nm处的OD值在0.8-1.0之间时进行β-半乳糖苷酶酶活的测定
4.数据分析
对测得的半乳糖苷酶的酶活进行数据分析
4. 研究创新点
1.提取根系分泌物通过将根破碎然后用酒精浸提，与一般的沙培、土培或水培法提取根系分泌物相比，所需时间更少，提取效率更高
5. 研究计划与进展
1.构建基因表达载体
需要时间：10-14天
2.根系分泌物的提取
