1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
真核生物基因组中包含有大量的转座子序列和dna重复序列，它们常处于转录失活状态，转座子的沉默是由sirna(small interfering rnas)介导的[1]。
在细胞质中，sirna通过碱基互补配对，降解靶标mrna来诱发转录后水平的基因沉默(post-transcrintional gene silencing, ptgs)，而在细胞核中，sirna则通过调节dna甲基化和组蛋白修饰的变化来诱发转录水平的基因沉默(transcrintional gene silencing, tgs)。
异染色质主要存在于基因组中高度重复序列和转座子富集区域，异染色质的形成与dna和组蛋白甲基化修饰有密切关系。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标： 解析小rna结合蛋白argonaute对组蛋白甲基化修饰的调控机理。
2.研究内容：（1）小rna结合蛋白argonaute对h3k9甲基化修饰的影响；（2）sirna对h3k9甲基化修饰的影响；（3）检测argonaute与suvh4/5/6间是否存在互作。
3.拟解决的问题： 通过研究argonaute对h3k9甲基化修饰的影响及其与suvh4/5/6间是否直接相互作用，来解决rddm途径中的sirna-ago沉默效应复合物是否可以直接招募组蛋白甲基转移酶suvh4/5/6进行异染色质修饰的问题，进而解析ago蛋白调控组蛋白甲基化修饰的机制，阐明dna甲基化和组蛋白修饰的关系。
3. 研究的方法与方案
1.研究方法：（1）荧光素酶互补实验(split-luc assay)检测蛋白间的相互作用（2）酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)检测蛋白间的相互作用（3）western杂交检测染色质组蛋白甲基化水平2.技术路线：（1）检测突变体ago4、ago6、suvh4/5/6、nrpd1、rdr2、nrpe1、drm2的h3k9甲基化水平→sirna-ago沉默效应复合物等rddm途径的主要组分对h3k9甲基化修饰的影响（2）检测ago1/4/6/9与suvh4/5/6间的互作→sirna-ago沉默效应复合物是否可以直接招募suvh4/5/6进行h3k9甲基化修饰（3）通过(1)(2)解析小rna结合蛋白argonaute调控组蛋白甲基化修饰的机理3.实验方案：（1）split-luc实验检测ago1/4/6/9与suvh4/5/6间的互作 ①构建atago1/4/6/9-cluc、atsuvh4/5/6-nluc瞬时表达载体，并转入农杆菌gv3101； ②将包含农杆菌的烟草转化液注射至烟草叶片，三天后采集荧光，根据荧光的情况即可确定蛋白间的互作。
（2）yeast two-hybrid 实验检测ago1/4/6/9与suvh4/5/6间的互作 ①构建atago1/4/6/9-bd、atsuvh4/5/6-ad载体，同时共转入酵母； ②涂布在二缺sd培养基上，将不同酵母单克隆点至二缺和三缺sd培养基上，看酵母是否能正常生长以确定蛋白间的互作。
（3）western blot检测拟南芥野生型和突变体ago4、ago6、suvh4/5/6、nrpd1、rdr2、nrpe1、drm2中的h3k9甲基化水平。
4. 研究创新点
（1）本实验应用荧光素酶互补实验和酵母双杂交两种方法验证蛋白间的互作，防止假阳性，保证实验的准确性。
（2）应用Western Blot从细胞及组织的整体水平上检测ago4等突变体的H3K9甲基化水平，研究siRNA-AGO沉默效应复合物等RdDM途径的主要组分对H3K9甲基化修饰的影响。
5. 研究计划与进展
一、研究计划：1、收集资料，阅读大量文献，掌握该课题的最新研究进展；2、完善研究项目的试验方案并确定实验方案；3、构建LUC载体，进行Split-Luc实验检测AGO1/4/6/9与SUVH4/5/6间的互作；4、构建BD、AD载体，进行酵母双杂实验检测AGO1/4/6/9与SUVH4/5/6间的互作；5、种植拟南芥野生型和突变体，并进行基因型鉴定；6、提取总蛋白，进行Western Blot检测突变体H3K9甲基化水平；7、处理实验数据；8、结合文献开始完成论文写作。
二、预期进展：1、2017.9-2017.10收集资料，查阅相关文献2、2017.10-2017.12构建LUC载体，完成Split-Luc实验3、2017.12-2018.2构建BD、AD载体，完成酵母双杂交实验4、2018.3-2018.5种植拟南芥，完成Western Blot实验
