伞滑刃属线虫RAPD分子标记的筛选开题报告

1. 研究目的与意义

松萎蔫病（Pinewiltdisease，简称PWN)是以滑刃目伞滑刃属（Bursaphelenchus）的松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)为主导的，综合人为因素、线虫及其伴生细菌、媒介昆虫及其伴生真菌、寄主松树以及环境因素互作的复杂病害系统。目前，已严重破坏了我国松林的生态系统。但在死亡和有萎蔫症状的松树里常常发现拟松材线虫(Bursaphelenchusmucronatus)的存在，它们有时混生，有时会单独出现。就二者在致病性上而言，松材线虫（B.xylophilus）是松材线虫病的病原，具有极强的致病性，无论在野外还是人工接种条件下都能引起松树迅速萎蔫。近几年的研究发现，分布广泛的拟松材线虫也具有较强的致病性。而且随着随着我国进出贸易的频繁，出现了越来越多不同地理来源的线虫群体，尤其是法国拟松材线虫群体、无致病性的线虫群体以及M型松材线虫群体的发现，松材线虫和拟松材线虫作为两个种的形态界限越来越模糊。故准确鉴定两种线虫及其杂交种，对于严格的检疫制度，防止松材线虫流行蔓延具有重要意义。

2. 国内外研究现状分析

1986年Mamiya等人通过松材和拟松材线虫杂交发现F1代不育也不能与亲本回交，认为松材线虫和拟松材线虫应为两个独立种；我国刘伟、杨宝君（1994）等用中国不同株系的松材线虫和拟松材线虫与其他国家的松材线虫和拟松材线虫进行种间杂交试验，他们运用杂交方法对来自南京、四川、日本、法国和加拿大等地的松材线虫和拟松材线虫共10个株系做遗传分析，结果表明中国的松材线虫和拟松材线虫能杂交成功，但后代数量少且大多不孕，两者间遗传差异较大，这两种线虫各株系间无明显差异。当中国线虫分别与日本、法国、加拿大株系杂交时，无论种间或种内均有差异，前者差异更明显。种间杂交种多数后代雌虫较难与父本回交产生子代幼虫。种间杂交在产生正常后代的同时也产生10%-60%的畸形后代。雄虫畸形主要表现在无交合刺或交合刺不发育，雌虫和幼虫的畸形则是身体的缢缩、弯折等。他们得出的结论是松材线虫和拟松材线虫虽然在人工实验条件下能杂交成功，但由于中间杂交后代数量少且不能连续繁殖下去等因素的存在，所以认为在自然条件下中国的松材线虫不会通过与拟松材线虫的杂交而导致疫区扩大。所以在接下来的十余年来，我国没有人再进行过此类研究。但是Haja-uk(1988)用一个日本松材线虫株系与法国拟松材线虫株系进行杂交，发现二者具有很高的杂交潜力，且杂交后代可以产生多代（F2、F3、F4代）且繁殖能力很很强；Bolla等(1993)收集了北美、日本和法国松材线虫与拟松材线虫虫株，发现这些虫株有很多可以杂交，且F1代可繁育F2等后代；Braasch(1994)用德国拟松材线虫株系与日本松材线虫株系杂交，发现二者也能杂交并产生有致病能力的后代；DeGuiran(1989)，Riga(1992)也得到了相同的结果。南京农业大学季宏铁（2004）重新研究了二者的杂交。他收集了亚洲和美洲的松材线虫株系，欧洲和亚洲的拟松材线虫株系进行杂交。杂交结果发现绝大多数松材线虫和拟松材线虫杂交产生的后代在一代或多代之后就不再可育繁殖，来源于欧洲的拟松材线虫可以与来源于北美洲的松材线虫产生可育的杂交后代；但来源于亚洲的拟松材线虫并不能与来源于北美洲的松材线虫产生可育的杂交后代。对杂交后代的DNA的ITS区进行PCR扩增，并用五种内切酶对扩增产物酶切后发现，杂交后代的ITS-RFLP较复杂，随着培养代数的增多，其酶切图谱也有一定的变化。线虫种间杂交后代的致病性处于两亲本之间。张立海等用PCRSSCP(单链构象多态性)技术对rDNA进行分析，实验结果表明，由于松材线虫与拟松材线虫在rDNA中的ITS1区存在着碱基差异性。而PCRSSCP检测DNA的碱基为400bp左右，因此这种差异可大幅度改变单链DNA的构象及迁移率，从而使之被检出，将两种线虫区分开来。此外，根据松材线虫和拟松材线虫两种间一些特异性的DNA序列，设计特异性的引物来进行特异性的扩增也可以达到鉴别两种线虫的目的。吴小芹等利用RAPD分析表明松材线虫和拟松材线虫无论是种间还是种内都存在较丰富的DNA序列多态性，而拟松材线虫种内的多态性更为丰富。在Nes遗传距离Dxy≈0.77处，不论它们的地域和寄主关系如何，均可明显区分松材线虫和拟松材线虫。陆伟等利用PCR-RFLP和DNA测序技术对ITS区在松材线虫和拟松材线虫鉴定中的价值及在种间及种内群体亲缘关系方面进行了评价，分析了松材线虫和拟松材线虫对编码核糖体RNA基因中的非编码区(ITS区)的部分区段的序列。通过对ITS区的PCR-RFLP分析发现，5种限制性内切酶(AluI,Hae11I,HhaI,MspI和TaqI)酶切结果无一例外均可区分松材线虫和拟松材线虫，可见松材线虫和拟松材线虫rDNA的ITS区存在着显著的差异。赵立荣等选择松材线虫rDNA的部分核甘酸序列作为目标序列，在ITS1区设计了松材线虫和拟松材线虫的特异性引物，又在518s区设计了松材线虫和拟松材线虫的通用引物。扩增试验表明松材线虫和拟松材线虫分别有自己的特异性带；而滑刃线虫与真滑刃线虫没有带扩增。该方法不仅检测单条线虫是否是松材线虫或拟松材线虫，而且还能够检测混合线虫样本是否含有松材线虫或拟松材线虫。陈凤毛等应用PCR-RFLP技术分析了松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA-ITS区片段长度约为890bp,拟松材线虫rDNA-ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明，内切酶DraI、SalI可以用于检测松材线虫与拟松材线虫，而MspI、ApaI、XhoI不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。另外，贾正辉等人也应用PCR-RFLP技术对来自四川省8个地方的枯死松树样品中的伞滑刃属线虫群体进行了分子鉴定。通过对AluⅠ、HhaⅠ、SalⅠ、DraⅠ4种内切酶除SalⅠ都能将松材线虫和拟松材线虫区分开,与陆伟等所得结果相近，和陈凤毛所得的结果基本一致。该技术可以明显区分松材线虫和拟松材线虫，并与形态学分类相吻合。与其他分子技术系相比，操作相对简单，用时短，准确性高，目前已在全国范围内推广应用。

3. 研究的基本内容与计划

1、利用灰葡萄孢活化冷冻的线虫（abx、frbx、ynbx、cbm、cqbm、japbm）并转接

2、对转接成功的线虫进行dna提取

3、进行pcr制胶、跑胶,引物筛选并对bx和bm进行多态性分析

4. 研究创新点