枯草芽孢杆菌高密度发酵氮源优化开题报告

1. 结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写2000字左右的文献综述：

文 献 综 述

1研究背景

随着经济的发展,能源问题日益引起人们的关注和重视。专家预计,在未来50年, 石油、天然气、煤炭等不可再生能源仍然是世界经济发展的主要能源。另一方面, 通过一次、二次石油开采, 仍然有大约60%的石油残留在地下无法被利用^[1]。而近年来兴起的微生物采油技术相对于传统的采油方式经济、环保，可以解决许多现实应用中遇到的问题，提高了采油率^[2]（室内研究表明, 微生物采油可在原有基础上提高采收率5%-12%^[3])。

微生物采油是指将地面分离培养的微生物菌液和营养液注人油层, 或单纯注入营养液激活油层内微生物,使其在油层内生长繁殖, 产生有利于提高采收率的代谢产物, 以提高油田采收率的采油方法^[3]。从微生物采油技术所用的微生物来看，包过激活油层内源微生物和注入引入外源微生物。与外源微生物采油技术相比，内源微生物采油技术不需要向地层中注入微生物，通过添加激活剂营养，并注入一定量的空气直接激活地层中的微生物，现场不需要添加大型地面设备，操作简单，经济环保，因而具有更为广阔的应用前景^[4]。枯草芽孢杆菌就是一种内源微生物，它代谢的脂肽生物表面活性剂具有优良的乳化和降低油水界面张力的能力^[5], 并可以适应油藏中复杂的环境, 可提高采收率，在微生物采油中具有较好的应用前景^[6]。

所以对枯草芽孢杆菌发酵进行优化是很有必要的，而高密度发酵培养是降低枯草芽孢杆菌发酵菌剂成本重要方法之一。

2 研究的现状及分析

2.1 枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是芽孢杆菌属的代表种。细胞直杆状，很少成链，染色均匀。借周生鞭毛运动。革兰氏阳性菌。芽孢椭圆或圆筒状，壁厚，位于细胞的中央或近中央。琼脂培养基上的菌落呈圆形或不规则，表面色暗，不透明，有皱褶，可变为奶油色或棕色。当琼脂表面湿润时，菌落易于扩散，在琼脂表面生长的菌苔在液体中不易扩散。在液体培养中表面形成暗色、皱褶和完整的菌膜，菌液轻度混浊或不混浊。在基础培养基生长时不需要维生素，可以葡萄糖和铵盐作为唯一的碳源和氮源。主要营有氧呼吸，在含有葡萄糖的复杂培养基中可进行无氧呼吸，但其生长和发酵都很弱，主要产物为2，3-丁二醇、乙酰甲基甲醇和CO₂。

枯草芽孢杆菌作为自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，在生长代谢过程中能够产生多种抗菌物质，主要是一些有机酸、多肽和前体肽。这些抗菌物质对食品中的多种腐败菌及致病性细菌有较强的抑制和杀灭作用，且易被人、畜体内的蛋白酶降解，从而被人体吸收，不会在体内残留^[7]。

2.2 高密度培养

又称高密度发酵,一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。若能提高菌体培养密度，提高产物的比生产速率(单位体积单位时间内产物的产量)，不仅可减少培养容器的体积、培养基的消耗和提高下游工程中分离、提取的效率，而且还可缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成本，因此具有重要的实践价值^[8]。

2.2.1 影响高密度培养的因素

2.2.1.1 培养基

在高密度培养过程中, 半限定培养基常用作高密度发酵培养基。它是在限定培养基基础上添加能有效促进细胞生长、代谢产物形成的不同物质( 少量天然物质、盐类、适当的痕量离子和氨基酸) 获得的。在实际培养过程中, 可以根据产生菌的特性和产品需求有效地控制基质培养基的品种和用量, 进行深入分析以获得适合菌体生长繁殖的增殖培养基^[9]。

对枯草芽孢杆菌来说，它利用单糖和二糖的能力优于淀粉,利用可溶性淀粉的能力优于玉米淀粉，利用有机氮源的能力优于利用无机氮源。枯草芽孢杆菌生长的最适氮源是酵母浸出物,这与酵母浸出物富含氨基酸、维生素及未知生长因子有关。从发酵成本考虑,酵母浸出物、胰蛋白胨及氯化铵组成的复合氮源较合适。^[10]

2.2.1.2最适温度

最适温度随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段变化而改变。不同的微生物最适生长温度范围存在一定的差异。温度的变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质, 另一方面影响发酵液的物理性质^[11]。

2.2.1.3 pH 值

pH主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性及营养物质离子化程度,从而影响菌体对养分的吸收^[10]。在高密度培养过程中, pH 值的变化是菌体产酸或产碱等生化代谢反应的综合结果, 也是确定补料速率的依据, 把两者紧密结合起来可以实现高密度培养发酵过程的优化^[9]。

2.2.1.4 溶氧浓度（DO）

在高密度培养中, 溶氧浓度的高低对菌体生长、产物的合成以及产物的性质都会产生不同的影响。随着菌体密度的增加, 单位体积培养物的摄氧率增加, 使发酵罐内溶氧水平逐渐下降, 低于临界氧浓度时就会抑制菌体生长。Meyer 和Fiechter ^[12] 曾报道, 需氧发酵并不是溶氧越高越好。适当的溶氧水平有利于菌体生长和产物合成, 但是溶氧太高有时会抑制产物的形成。因此, 可以通过控制菌的比生长速率, 使溶氧浓度保持在比临界值略高一点的水平, 达到这一目的。

2.2.2高密度培养的途径

2.2.2.1 透析培养

所谓透析培养是指在围有半透膜的培养环境中, 使微生物生长的方法^[13]。采用这种培养方式, 不仅可以增加生物量的积累, 而且大大降低营养物质的损失。 与微滤和超滤相比,在透析过程中透析膜不会被阻塞, 并且可以很长时间维持其渗透性能^[14]。但是, 由于反应器本身需要内嵌的透析膜或外在的透析组件、辅助泵及其它发酵罐等, 透析培养的设备投资较大。

2.2.2.2 细胞循环培养

通过某种方式将细胞保留在培养罐中加以循环利用的培养方式就是细胞循环培养。一般通过沉降、离心和膜过滤这3种方式进行^[15-16]。细胞循环可以除去抑制性代谢产物, 可以用低浓度的培养基得到高的细胞密度, 可以就地分离产物, 有利于下游操作。

2.2.2.3 补料分批培养

补料分批培养是一种介于分批培养和连续培养的单元操作^[17]。在补料分批培养过程中, 补料策略的选择是高密度发酵成功的关键。补料分批培养^[18]可以通过消除底物抑制, 延长次级代谢产物的生产时间, 稀释有毒代谢产物,最终达到细胞高密度培养, 并降低染菌机率和避免遗传不稳定性。

3 研究的目的及意义

本课题研究的目的：了解枯草芽孢杆菌的性质和分类；掌握影响高密度培养的因素和培养途径。采用高密度培养技术，通过对采油微生物枯草芽孢杆菌发酵条件的优化,获得浓度较高的菌落数，进而达到利用生物驱手段，提高石油采出率的目的。

本课题研究的意义：枯草芽孢杆菌是具有驱油作用微生物之一，而采用微生物驱油是现在油田三次开采重要技术之一。因此枯草芽孢杆菌高密度发酵技术的优化对于该菌株应用于油田开采具有重要意义。而且还有助于微生物技术在其他方面的应用，为解决能源问题带来了新的希望。

参考文献

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2. 本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段（途径）：

1研究目的

本实验采用高密度培养技术，通过对采油微生物枯草芽孢杆菌发酵条件的优化，主要是培养基中碳源的优化，从而获得浓度较高菌落数。

2研究仪器

紫外分光光度计(752S型)，上海棱光技术有限公司；干燥箱(GZX-9140MBE型)，上海博讯实业有限公司；离心机(GL-20G-Ⅱ型)， 上海安亭科学仪器厂；恒温箱(SHP-150型)，上海精宏实验设备有限公司；雷磁pH S-3C精密pH极,上海精密科学仪器有限公司；隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；SWSW-CJ-1F型单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司。

3研究方法

3.1菌种及其来源

枯草芽孢杆菌，中国石油大学分离保存。

3.2菌种的活化及保藏

1）培养基配方

NaCL 5g/L、蛋白胨10g/L 、牛肉膏5g/L 、琼脂15g/L

2）菌种的活化

将冻存管中的菌液，放入37℃恒温水浴锅中快速复苏之后，接入灭过菌的液体肉汤培养基中，培养12h后，在固体肉汤培养基上四区平板划线，在培养箱中培养24h后，分离出单菌落，然后再转接两次之后可以作为发酵菌种使用。

3）菌种的保藏

分别取1ml新鲜枯草芽孢杆菌种子液于10支离心管中，经离心机离心后，去掉上层清液，再分别加入1ml的LB，与保护液甘油以1:2的比例分别装入2mL的冻存管中，然后在温度为4℃冰箱中放置1h，接着在温度为-20℃冰箱中再放置2h后，最后移入温度为-80℃冰箱中长久保存，以用来备用。

3.3枯草芽孢杆菌基本特性的研究以及基础生长曲线的绘制

1）枯草芽孢杆菌基础特性研究

观察平板四区划线的菌种单菌落的菌落形态、色泽、气味等表观现象，观察其在显微镜下的形态；

将斜面菌种接入若干液体培养基后观察培养基的颜色、气味变化。

总结实验现象，得出枯草芽孢杆菌基础特性。

2）基础曲线的绘制

用接种环将原始枯草芽孢杆菌菌种从斜面培养基接种至种子培养基中^[21]。接种过程注意接种量一致（1%的接种量）。每瓶种子50mL，36℃下，140rpm 培养，每2小时测定其OD₆₀₀、pH、CFU值,共需要培养24h。在测定过程中，OD₆₀₀值过高时，应该注意将种子液稀释到合适浓度，倾注时，注意无菌操作以及混合均匀等事项，以保证实验的准确性。

根据在不同时间测出的OD值和CFU值，可以绘制出枯草芽孢杆菌的生长曲线图，同时比对两者的曲线走势，并判定这两种曲线的准确性。

3.4枯草芽孢杆菌发酵条件优化中的氮源优化实验

分别将硝酸钾、硝酸钠、玉米浆、硫酸铵、尿素、氯化铵、酵母膏等七种物质代替发酵培养基中的蛋白胨，质量与蛋白胨相同。将发酵好的种子液均以1%的接种量接入上述不同的培养基中，每组实验共八组，每两个小时测定实验数据OD、pH、CFU，对比试验数据得出最佳实验结果，然后选择其为最佳氮源，然后选取2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L进行梯度优化实验，最终得到合适的氮源梯度，完成实验。

3.5 测定方法

（1) OD值的测定：菌体吸光度的测定采用比浊法,用紫外分光光度计测定菌液的OD(在600 nm时) 用未接种的培养基作为空白对照。

（2）pH值的测定：用pH计测定菌液pH，先用已知pH的标准缓冲溶液校正pH计。

（3）CFU值的测定：先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶ 10 、 1 ∶ 100 、 1 ∶ 1000 、 1 ∶ 10000 ），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温24h即可出出菌落。

指导教师意见：

1．对文献综述的评语：

2．对本课题的深度、广度及工作量的意见和对设计（论文）结果的预测：

指导教师：

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所在专业审查意见：

负责人：

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