分离提取细胞外囊泡的磁性微珠研制开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述）

细胞外囊泡（extracellular vesicles, evs）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡（microvesicles, mvs）和外泌体（exosomes, exs）组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm–1000nm。外泌体是一种具有脂质双层膜结构的微小膜泡，直径大约40-100 nm。外泌体由细胞内的多泡小体（multivesicular bodies）与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm-100nm。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液（血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁）中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、dna、mrna、mirna等，具有多种功能^[1]，例如，它在细胞通讯中能够介导功能性蛋白质、脂质、核酸以及其他特异性物质在细胞间的定向传递；在免疫方面，它能够进行抗原的呈递；在肿瘤的生长与迁移方面，它能够促进癌细胞微环境的形成以及癌细胞的转移；在神经系统的发病与损伤修复方面，它能够促进神经退行性疾病相关错误折叠蛋白的清除或修复等，由于细胞外囊泡与多种生命活动息息相关，故其具有相当可观的应用价值，这使得细胞外囊泡成为了近年的研究热点，随着对这一认识的加深，细胞外囊泡正逐渐成为临床上的一种有效工具，协助疾病诊断及治疗，为生命科学带来不少新的认识和应用。

然而，细胞外囊泡的获取至今都还存在着一定的问题，虽然目前存在多种提取方法^[2-3]，包括超速离心法、超滤法、沉淀法、免疫亲和法，但这些提取方法均存在各自的问题，目前比较认可的方法是用超速离心^[4]，它先通过低速离心，去除细胞、细胞碎片等大的微粒，然后再在100000xg的速度下离心2h，细胞外囊泡可以离心下来，蛋白质、核酸等分子仍保留于上清，从而达到分离的目的，超速离心方法提取纯度高，样品容量大，但耗时长，操作繁琐，设备价格昂贵，同时可能会破坏囊泡的完整性，进而影响下游分析；超滤法^[5]是根据细胞外囊泡的大小使用相应截留分子量的超滤膜，采用超滤技术，配合离心去除残余细胞、0.22μm滤过膜过滤除去细胞碎片、大分子囊泡等，具有操作简单、省时、成本低的优势，提取细胞外囊泡的产量和效率均高于超速离心法，但由于小于膜孔的非细胞外囊泡成分或灵活性好的混杂蛋白可通过滤过膜，从而引起细胞外囊泡纯度不足，此外，细胞外囊泡可能会堵塞膜孔影响分离效率；沉淀法^[6]是基于细胞外囊泡大小及部分理化性质与病毒极其相似，聚合物peg会束缚水分子，将溶解度较低的组分从溶液中挤出,改变细胞外囊泡的溶解度或分散性的原理从而达到提取分离目的的方法，沉淀法操作简单，无需特殊的技术及设备，产量高，可用于下游分析试验，但因可能会沉淀非细胞外囊泡的疏水物质及其他蛋白，获得的细胞外囊泡纯度不高；免疫亲和^[7]指用相关抗原的抗体如抗cd9、抗cd63等包被微球表面，与样本孵育结合，将样本中的细胞外囊泡吸附并分离出来提取方法，免疫亲和方法特异性高，提取目标产物纯度高，但其试剂成本高，只能针对特定抗原，容量低，产率低，只适用于无细胞样品，同时该方法提取的细胞外囊泡与抗体结合紧密，非中性和非生理性盐浓度的洗脱会影响细胞外囊泡生物活性，不利于下一步实验。

核酸适配体^[8]（aptamer，又称核酸适体、适配子）是通过模拟自然进化过程的人工筛选技术——指数富集配体系统进化技术 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, selex)，体外筛选得到的新型核酸分子。rna或单链dna中一些碱基之间的互补配对、氢键作用和静电作用等产生折叠，得到了较为稳定的三维空间结构，如假结(pseudoknot)、发卡hairpin)、g-四分体(g-quartet)、凸环(stem loop)等。由此产生的单链核酸在结构上的复杂性和空间构象的多样性，使适配体与各种配体之间能够专一性结合。适配体具有分子量小，易于合成，成本较低，比抗体更加稳定，可以在 5’端和 3’端进行选择性修饰等诸多优点，在生物分析检测领域应用前景广阔。目前已存在核酸适配体相关研究应用于细胞外囊泡的分离与检测，例如：利用带有生物素的核酸适配体标记细胞外囊泡，然后通过修饰有链霉亲和素的磁珠捕获被标记的细胞外囊泡，以达到提取分离的目的^[9]；将核酸适配体通过分子组装技术组装成nth纳米四面体，通过与电化学传感器相连检测细胞外囊泡的存在^[10];将核酸适配体与3种mdna结合在磁珠表面，通过电化学检测结合细胞外囊泡释放mdna的扩大信号从而定量检测细胞外囊泡^[11];将结合有适配体的磁珠与cy3(酞菁类荧光探针)通过互补作用结合，在有细胞外囊泡存在的条件下，cy3脱落，进而通过检测荧光强度达到检测细胞外囊泡的目的^[12]。

2. 研究的基本内容与方案

2.1 研究的基本内容与目标

1.合成粒径适合要求的磁性微粒。

2.寻找合适的磁珠修饰方法并修饰磁珠。

3. 研究计划与安排

第一阶段：准备阶段

第1-9周

（1）确定研究课题，查阅并整理相关文献

4. 参考文献（12篇以上）

[1]ra k and va l.the biology, function, and biomedical applications

of exosomes[j].science,2020,367(6478):1095-9203

[2]贺娇,许泼实.外泌体提取方法及鉴定分析研究进展[j].中华实用诊断与治疗杂志,2018，32(7):718-721