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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 1.研究概况和意义 随着我国经济的发展，城镇化进程的加速，环境污染也日益加重。重金属污染是我国环境污染的主要形式之一，其主要来源是造纸、印刷、化工等企业排放的不达标废水，这些企业将含有重金属污染物的污水排放到附近河流中，这不仅污染了水源，还会在下游农民引流灌溉农田时进一步污染农田，导致农作物产量低下，并且收获的农作物重金属含量超标。 2003年报告显示，我国镉污染耕地为1.33×104 hm2，有11处污灌区土壤镉含量已经达到生产“镉米”的浓度。2014全国耕地土壤点位超标率为19.4，其中，镉污染物点位超标率达到7.0，是主要的重金属污染物之一。目前我国镉污染土壤的面积已达2×105 km2，占总耕地面积的 1/6，涉及11个省市的25个地区，部分地区的污染十分严重。 虽然铅污染不及镉污染严重，但是铅污染问题仍不容小觑，当铅的浓度达到0.1mg/L时，便可抑制水体的自净作用，并且和别的重金属污染物一样，会逐渐在生物体内富集，由于其不能被生物代谢分解，在环境中会成为持久性污染物。铅污染主要来源于原生铅的冶炼、电镀废水排放等生产活动中需要用到铅的企业，因为工艺技术落后、企业管理不善、监管力度不够等原因，铅污染也逐渐成为一个急需解决问题。 我国是农业大国，重金属污染问题方方面面都影响着农业生产，寻找缓解该问题的方法是时下热门的研究课题，许多学者就从生物修复的角度进行突破，得出了许多成果。 生物膜是微生物面对恶劣生存环境产生的一种复杂聚集体，生物膜中的微生物对逆境的抗性会更强，形成生物膜的微生物对抗菌药物、抗菌剂的抗性大大增强，甚至可以躲避宿主免疫系统的打击，Gail等人的研究表明生物膜中细胞对重金属胁迫的抵抗能力提高了2-600倍；也有学者发现生物膜对一些环境中的重金属离子有吸附作用，kim等人研究了生物膜对多种土壤颗粒中重金属离子的吸收特性，在有生物膜附着情况下，24小时后土壤中的部分重金属离子（Pb,Cd, Ni, Zn）含量显著低于对照组，这些研究就可以成为解决重金属污染问题的一个突破口。 本课题通过研究枯草芽孢杆菌B9、B9△ywcC突变株和B9△slrR突变株生物膜对土壤重金属铅、镉有效态含量的影响，有利于理解如何利用枯草芽孢杆菌B9菌株及其突变株生物膜钝化土壤中的重金属铅镉。 2.应用前景 生物修复重金属污染土壤方面的研究现在已经逐渐成为热点，本课题研究的是枯草芽孢杆菌B9、B9△ywcC突变株和B9△slrR突变株生物膜对土壤重金属铅、镉有效态的影响，势必有助于了解生物膜钝化环境中重金属铅镉的能力，推测其可能机理。 主要参考文献 [1] Myoung-Soo Ko,Hyun-Sung Park, Kyoung-Woong Kim, Jong-Un Lee. Experimental Study onStabilization of Heavy Metals by Biofilm Developed on Soil Particle Surface[J]. Journalof the Kean Society of MineralEnergy Resources Engineers,2010,47(2)158-167. [2] 陈云.枯草芽孢杆菌生物膜在青枯病生防中的功能研究及Cyclic-di-GMP信号通路初探[D].南京：南京农业大学，2012：24-32. [3] 宋玉婷，雷泞菲.我国土壤镉污染的现状及修复措施[J].西昌学院学报（自然科学版）,2018,32(3)79-83. [4] 肖承坤.我国铅污染现状分析[J].环境与可持续发展,2017,591-92. [5] 韩倍雷.我国农田土壤重金属污染现状及检测技术分析[J].环境与发展,2018,8160-162. [6] 陈潇君.溶液pH值对铅、镉在自然水体生物膜上吸附与解吸动力学过程的影响[D].长春：吉林大学，2002：30-33. [7] Gail M.Teitzel, Matthew R. Parsek. Heavy Metal Resistance of BiofilmPlanktonic Pseudomonas aeruginosa [J]. Applied Environmental Microbiology, 2003,69(4)2313-2320. [8]陈小楠,申元娜,李彭宇,邹祎晴,胡海燕.细菌生物膜的特征及抗细菌生物膜策略[J]. 药学学报,2018(53) 1-10. [9] 欧美珍,凌均棨. 多胺对细菌生物膜作用的多样性[J]. 国际口腔医学杂志.2014, 42(3)361-363.
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2. 研究的基本内容和问题
| 3.研究目标 在土壤中接种枯草芽孢杆菌B9、B9△ywcC和B9△slrR生物膜、菌体进行培养，初步测定枯草芽孢杆菌B9、B9△ywcC和B9△slrR生物膜及菌体对土壤铅镉钝化能力及对土壤酶活、pH、可培养细菌数量的影响。 4.研究内容 测定枯草芽孢杆菌B9、B9△ywcC和B9△slrR生物膜及菌体对土壤重金属铅镉的钝化能力；对土壤脲酶活性、蔗糖酶活性的影响；对土壤pH的影响；对土壤可培养细菌数目的影响。
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3. 研究的方法与方案
6.研究方法
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| 培养枯草芽孢杆菌B9、B9△ywcC和B9△slrR生物膜，获得生物膜及菌体 |
| 将样品接种入铅镉污染的土培养 |
| 取样，测定培养液样品土壤样品铅镉有效态含量、土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性、土壤pH |
| 记录数据，分析实验获得的数据，绘制图表 |
实验方案： 实验处理 1.2.1实验处理 表1 处理设置 Table1 Treatments 处理 重复数量 接入 土壤质量(g) CK 3 1 ml无菌水 1 B9菌体 3 1 ml菌体悬液 1 B9△ywcC菌体 3 1 ml菌体悬液 1 B9△slrR 菌体 3 1 ml菌体悬液 1 B9灭活后菌体 3 1 ml灭活菌体悬液 1 B9△ywcC灭活后菌体 3 1 ml灭活菌体悬液 1 B9△slrR灭活后菌体 3 1 ml灭活菌体悬液 1 B9 生物膜 3 1 ml生物膜液 1 B9△ywcC 生物膜 3 1 ml生物膜液 1 B9△slrR 生物膜 3 1 ml生物膜液 1 B9灭活后生物膜 3 1 ml灭活生物膜液 1 B9△ywcC灭活后生物膜 3 1 ml灭活生物膜液 1 B9△slrR灭活后生物膜 3 1 ml灭活生物膜液 1 数据处理和图表绘制 采用Excel和SPSS 统计软件对数据进行统计分析，数据结果用平均值±标准误表示，用Duncan多重比较分析在P0.05水平上是否具有差异显著性，采用Origin 软件作图和处理图片。 7.可行性分析 经过文献的查阅，我了解到生物膜具有吸收重金属离子的特性，为枯草芽孢杆菌B9、B9△ywcC和B9△slrR生物膜吸收铅镉离子提供了理论依据，同时我也从前人的试验中汲取到一定经验，课题导师也在环境与地质微生物学等领域有非常深入的研究，本课题在南京农业大学生命科学学院的生科楼进行，有良好的实验器材及设备。以上条件为本课题提供了可行性，可达到预期目标。
4. 研究创新点
8.特色或创新之处
针对枯草芽孢杆菌b9、b9△ywcc和b9△slrr生物膜对土壤铅镉有效态影响的研究还未见报导，研究内容有一定新颖性。
5. 研究计划与进展
9.研究计划
（1）2018.12-2019.01
查阅文献了解生物膜的特性与组成，以及形成生物膜的相关基因，了解实验中的相关技巧，确定实验方案和所需使用的设备、材料。
