人工设计大肠杆菌模式群落探究微生物的合作机制及欺诈者效应开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

synthetic ecology(合成生态学) 是一门综合使用合成生物学手段和生态学原理构建稳定微生物群落的新兴学科。作为合成生物学和生态学的交叉学科，合成生态学的总体研究方法是使用生物工程方法来设计并构建具有特定性质的菌株，并进一步基于生态学理论来将这些菌株组合成微生物群落。我们可以使用这些人工合成的微生物群落来优化单一工程菌株的生产过程以达到提高产量的目的；我们也可以将这些人工合成的微生物群落作为模式群落来研究进化、物种关系、生态功能相关的各种生态学问题。在生态学研究中，这样的模式群落具有生长周期短、稳定性高、易培养、易控制变量、灵活性好、易建模等优点。

互养（crossfeeding）作为微生物间的一种重要合作方式广泛存在于自然微生物群落中。不同的微生物相互间分享特定的代谢产物或营养物质，以更好地适应环境，这样的合作方式称为互养。关于互养，自然界中存在的典型的例子有：厌氧甲烷氧化菌和硫还原细菌之间的互养，牛羊肠道微生物间基于氢离子的互养，等等。微生物的互养有着不同的途径，包括：微生物将代谢产物或营养物质直接释放到环境中作为公共产品（public goods）供附近的微生物使用；微生物间通过纳米管（nanotubes）的连接定向地传输代谢产物或营养物质等等。在微生物间的互养过程中，存在着一个称为公共地悲剧（tragedy of the commons）的潜在问题：微生物群落中可能出现只获取公共产品却不提供有用物质的菌株，这样的菌株称为欺诈者（cheaters），欺诈者的出现可能影响微生物间的合作关系甚至导致互养系统的崩溃。目前我们对于微生物互养系统如何抵御欺诈者还没有统一的结论。了解微生物间合作建立的进化机制，以及弄清互养微生物群落如何应对欺诈者效应，对于理解微生物间的相互作用、预测微生物群落的功能变化有着重要的意义。

目前，有国外学者通过人工构建的氨基酸营养缺陷型菌株以及氨基酸过表达菌株来研究微生物互养及欺诈者效应。他们将缺某种氨基酸却能过量合成另一种氨基酸的不同菌株组合成简单的人工微生物群落，这些菌株间就形成了基于氨基酸的互养关系；同时，通过加入只缺某种氨基酸却不过表达其他氨基酸的菌株，就引入了欺诈者。基于这样的人工互养系统，国外学者研究了微生物间的合作关系以及微生物群落是如何应对欺诈者的，但是不同的课题组得到了不同的结论。有人使用基因工程编辑的酵母菌作为研究对象，发现酵母菌通过死亡后将氨基酸释放到环境中达到基于不同氨基酸的互养，这样的系统通过进化出强壮的后代来逐渐排除欺诈者；而另一项基于大肠杆菌的研究则发现，不同营养缺陷型大肠杆菌之间通过纤毛连接，交换各自所需的营养物质。这里，我们使用大肠杆菌模式群落作为研究对象，验证这两种猜想哪种更符合实际情况，并通过欺诈者的加入探究互养的大肠杆菌群落如何排除欺诈者。

2. 研究的基本内容和问题

1.探究两个合作者（cooperaters）交换蛋白质和营养物质的方式。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1.基因敲除（knockout）

基因敲除是一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽。我们采取的大肠杆菌基因敲除方法为传统的重组法，即通过合成无义的与目标序列同源的dna片段，利用大肠杆菌的rec酶系统，通过同源重组替换掉相应的dna片段达到敲除的目的，构建不同的大肠杆菌菌株。

4. 研究创新点

1. 通过基因编辑手段构建大肠杆菌菌株并组成人工微生物群落。

2. 通过荧光标记和qPCR等手段来实现微生物群落的计数。

5. 研究计划与进展

研究计划：

3月12日-3月20日，将质粒导入中间体

3月21日-3月28日，将质粒从中间体导入突变株