1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.研究意义：目前我国的农业生产处于高能耗、高污染的状况，2010 年我国化工企业生产氮肥近5000 万吨(其中使用煤炭和天然气作为氮素生产能源的比率分别为72%和26%)，全球达1.5 亿吨，但由于农作物的吸收率极为有限，其中的绝大部分都会随着地下水和河流进入海洋。
加上汽车等交通工具以及热电站所释放的含氮污染成分，人类每年向生物圈所排放的氮元素早已超出了地球处理能力的极限。
我国耕地面积占全球的7%，而年消耗氮肥占世界30%，氮肥利用率仅10-30%，人工施用化学氮肥流失率往往大于50%，多余的氮素会导致土壤酸化，破坏土壤和微生物原先的氮循环能力，因此降低化肥的使用，是迫在眉睫的。
2. 研究的基本内容和问题
目标：通过本实验，检测在体外条件下H2O2相关基因katG以及oxyR的调控机制内容：1.检测田菁根瘤菌ORS571 katG和oxyR敲除株对 H2O2 敏感性2.在H2O2的诱导下，OxyR对katG基因表达的调控作用拟解决的关键问题：1.katG和oxyR基因的敲除是否影响菌体的正常生长2.katG和oxyR基因对田菁根瘤菌ORS571菌株抵抗外源H2O2的作用
3. 研究的方法与方案
研究方法与实验方案：1.活化与转接1.1配置适合毛萼田菁茎瘤菌ORS571生长的TY培养基1.2将冷冻的已制备的野生型菌株WT、敲除株ΔkatG和ΔoxyR解冻1.3分别将野生型菌株WT、敲除株ΔkatG和ΔoxyR接种到TY培养基中培养1.4挑选TY培养基中茁壮的菌落，将其中部分菌落接种到新的培养基中培养2.侧生长曲线2.1将已活化的野生型菌株WT、敲除株ΔkatG和ΔoxyR按 1 %分别接种至含有 100 ug/mL氨苄青霉素的TY液体培养基中, 28 ℃摇床培养2.2每隔3小时取样，测定菌体浓度(OD600), 绘制生长曲线3.H2O2杀菌实验3.1收集稳定 期( OD600 = 1.0) 的待测菌液20 mL，用无菌水重悬3.2用2 mM和30 mM低浓度的H2O2条件下，对WT、ΔkatG和ΔoxyR于28℃处理2h3.3用无菌水洗涤去除 H2O2后， 稀释至十的负六次方点板测菌数，每个至少有 3个重复4.抑菌实验4.1将培养至稳定期( OD600 = 1.0) 的WT、ΔkatG和ΔoxyR与含0.6%的琼脂的TY培养基混合，并将其倒在TY平板（55mm直径）上4.2待 平 板 晾 干 后，将圆滤纸片（6mm直径）放置在平板中央，在上面点上4 ul 350 mM H2O2, 每种菌株3个重复4.3在24 h后测量抑菌圈的直径5.β-半乳糖苷酶活性的测定5.1对WT（pVIK112-PkatG）和ΔoxyR （pVIK112-PkatG）生长到一定阶段时，用H2O2进行处理测β-半乳糖苷酶活性。
6.植物盆栽实验6.1将适量的田菁种子放置在玻璃平皿中，加入浓硫酸， 以没过种为宜，处理 30 min6.2后用无菌水洗三次，种子 28 ℃避光催芽，每 12h将种子清洗一次，去除种子分泌物，待种子露白，即可种植6.3待毛萼田菁生长至 30天左右，活化相应的菌株至稳定期，调整 OD600 约为 0.1，处理后的菌株均匀的涂布在茎上， 置于温室中继续培养至形成茎瘤为止6.4在5-6 周后进行瘤数统计和利用乙炔还原法测量茎瘤固氮酶活技术路线：见附件
4. 研究创新点
田菁茎瘤菌（Azorhizobium caulinodans ORS571）中ROS的相关研究还知之甚少。
而本实验立足于ROS中的H2O2相关基因katG和oxyR的调控机制的研究，具有十分重要的意义。
5. 研究计划与进展
研究计划：2015.12~2016.1活化并培养田菁根瘤菌ORS571 katG和oxyR敲除株2016.3~2016.4测定田菁根瘤菌ORS571 katG和oxyR敲除株的生长曲线和对 H2O2 敏感性2016.4~2016.6探究OxyR对katG的调控关系及体内试验预期进展1.活化达到Δ katG，ΔoxyR，WT(pVIK112-PkatG）菌株2.通过测生长曲线，获得Δ katG，ΔoxyR，WT的菌株的表型差异3.在H2O2诱导下，OxyR对katG的调控作用4.通过检测瘤数瘤重表明katG和oxyR基因在田菁根瘤菌ORS571共生固氮作用
