1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.课题来源及选题依据 螺原体(Spiroplasma)是一类具有运动能力的真细菌。其基本形态为螺旋形，但在一定的生长阶段或条件下，还可呈现圆形、椭圆形、丝状分枝、球状突起及串珠状等多种形态。无细胞壁，但在系统发育分析上属革兰氏阳性菌[1]{, #1}。具有滤过性，能独立生活和自我复制。螺原体全基因组很小，约为780-2200 kbp，其中最小的菌株为Spiroplasma platuhelix PALS-1[2]，最大的菌株为Spiroplasma ixodetis Y32T[3]。 螺原体属于细菌域(Bacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，虫原体目(Entomoplasmatale)，螺原体科(Spiroplasmataceae)，螺原体属(Spiroplasma)。目前发现的螺原体有34个血清组，其中血清组Ⅰ有9个亚组，血清组Ⅷ和ⅩⅥ各有3个亚组，但仅38个种给与拉丁文双名并被详细描述[4]。昆虫是螺原体最主要的宿主，其中大部分螺原体是作为宿主的共生体，但有些昆虫感染螺原体后会出现致病现象。1976年，在美国Maryland州首次发现由Spiroplasma melliferum引起的一种蜜蜂病害螺原体死亡病(spiroplasmosis)[5]；此后，在法国发现由S. apis 引起的蜜蜂五月病(May disease) [6]。蜜蜂在被注射或喂食这两种螺原体后都会导致死亡，其中Spiroplasma melliferum所引起的蜜蜂死亡在群体水平上相对较轻。 研究发现，从个体水平上看，螺原体侵染能够导致宿主的神经系统损伤，使宿主丧失飞行能力；而从宏基因组学角度，螺原体在宿主体内与其他微生物形成共生体，相互之间影响和作用，通过调控宿主体内免疫应答，活性氧和抗氧化途径等，影响宿主的各项机能。也有一些学者从基因组学角度，通过研究螺原体中的可能存在的致病因子，分析螺原体对蜜蜂致病的机理。现阶段，国内外对螺原体致病机理的研究已经取得了一定的成果，然而还存在许多的不足，仍需要进一步实验探究。主要有以下几个方面： ①根据现阶段的研究可知，螺原体可以引起宿主体内一系列的免疫应答反应，同时也可以破坏宿主的神经系统，然而其中各项反应的具体分子机理仍未明了，还需要进一步的实验进行猜想和认证，这必定是下一阶段研究的重心，也是这个课题主要研究的方面。 ②大部分的与螺原体致病相关的免疫应答研究都是以蜜蜂外的昆虫作为宿主进行实验的，直接使用蜜蜂进行的相关实验并不多，同样的实验在蜜蜂作为宿主时是否会有相似的结果出现还有待更多的实验验证。 ③同时，蜜蜂螺原体的研究缺乏一套完整的遗传操作系统，这为分子水平研究螺原体带来了不便。主要的困难在于外源载体导入螺原体后不能利用螺原体自身的复制系统，会在传代过程中很快丢失，而这对于更清楚了解蜜蜂螺原体侵染宿主使宿主致病的分子机制很重要。因此这便是下一阶段所进行的一系列相关研究中必需要去克服的难点，也是接下来研究的一个关键突破口。 ④最后，研究蜜蜂爬蜂病致病机理的根本目的是在于防治，从而彻底解决这一农业病害。而截止目前，在致病机理尚未完全明了的情况下，国内外的研究者们还没能研究出切实有效的根治以及防止病害传播的方法。 |
2.国内外研究概况 在国内，陈永萱等于1988年首次从患爬蜂病的蜜蜂体内分离到螺原体菌株CH-1，并对其基本生物学特性作了详细的研究[7]。 最新的研究表明螺原体对于蜜蜂种群的致病性有限，蜜蜂种群的衰退与螺原体的侵染无明显关系[8]。2014年，Jeremy K Herren等研究人员发现当果蝇Drosophila melanogaster体内存在螺原体Spiroplasma poulsonii时，果蝇生长20天以后生存率出现明显下降，而此时螺原体在果蝇血淋巴中的浓度接近峰值，并且此时果蝇飞行能力开始丧失[9]。这说明虽然螺原体对于宿主的致病性有限，但并非无影响。有研究表明螺原体侵染果蝇宿主会激活宿主的体液免疫但却使得螺原体在宿主体内的浓度提高，并且还提高了宿主对某些革兰氏阴性菌的敏感性[10]。相似的情况在宿主为龙虾时也有发生，有研究表明螺原体侵染后能同时激活或者抑制宿主龙虾的免疫基因表达。该情况发生的具体机理还不甚明了[11]。研究蜜蜂螺原体对意蜂免疫应答和神经系统的影响对于发现其致病机理很重要。 3.应用前景 我国在动物支原体(Mycoplasma)和植物支原体(植原体Phytoplasma)已有较深入的研究，对于同属柔膜菌纲的导致中华绒螯蟹颤抖病的螺原体Spiroplasma eriocheiris也取得突破性进展，但是对于蜜蜂螺原体的研究却很少，研究力量十分薄弱[12]。蜜蜂螺原体病严重制约着我国养蜂业的发展，急需对其进行深入研究来帮助减少其对养蜂业造成的损失。 参考文献 [ 1 ] Regassa L B, Gasparich G E. Spiroplasmas: evolutionary relationships and biodiversity [J]. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library, 2006, 11: 2983-3002 [ 2 ] Carle P, Laigret F, Tully J G, et al. Heterogeneity of genome sizes within the genus Spiroplasma [J]. Int J Syst Bacteriol, 1995, 45(1): 178-181 [ 3 ] Williamson D L, Adams J R, Whitcomb R F, et al. Spiroplasma platyhelix sp. nov, a new mollicute with unusual morphology and genome size from the dragonfly Pachydiplax longipennis [J]. Int J Syst Bacteriol, 1997, 47(3): 763-766 [ 4 ] Gasparich G E. Spiroplasmas: evolution, adaptation and diversity [J]. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library, 2002, 7: d619-640 [ 5 ] Clark T B, Whitcomb R F, Tully J G, et al. Spiroplasma melliferum, a new species from the honeybee (Apis mellifera) [J]. Int J Syst Bacteriol, 1985, 35(3): 296-308 [ 6 ] Mouches C, Bove J M, Tully J G, et al. Spiroplasma apis, a new species from the honey-bee Apis mellifera [J]. Annales de microbiologie, 1983, 134A(3): 383-397 [ 7 ] 陈永萱, 薛宝娣, 郭永红. 蜜蜂螺原体基本性状的研究 [J]. 中国科学: B 辑, 1988, 31(2): 815-820 [ 8 ] Zheng H Q, Chen Y P. Detection of Spiroplasma melliferum in honey bee colonies in the US [J]. Journal of invertebrate pathology, 2014, 119: 47-49 [ 9 ] Herren J K, Paredes J C, Schupfer F, et al. Insect endosymbiont proliferation is limited by lipid availability [J]. Elife, 2014, 3: |
[10 ] Herren J K, Lemaitre B. Spiroplasma and host immunity: activation of humoral immune responses increases endosymbiont load and susceptibility to certain Gram-negative bacterial pathogens in Drosophila melanogaster [J]. Cellular microbiology, 2011, 13(9): 1385-1396 [ 11 ] Du J, Zhu H, Liu P, et al. Immune responses and gene expression in hepatopancreas from Macrobrachium rosenbergii challenged by a novel pathogen spiroplasma MR-1008 [J]. Fish shellfish immunology, 2013, 34(1): 315-323 [ 12 ] Meng Q G, Hou L B, Zhao Y, et al. iTRAQ-based proteomic study of the effects of Spiroplasma eriocheiris on Chinese mitten crab Eriocheir sinensis hemocytes [J]. Fish shellfish immunology, 2014, 40(1): 182-189 |
2. 研究的基本内容和问题
二、研究方案
（一）研究的目标、内容和拟解决的关键问题
1.研究目标
3. 研究的方法与方案
（二）拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
1.拟采取的研究方法及技术路线分析
1.1研究材料
4. 研究创新点
（三）、本课题的创新之处
近几年我国在动物支原体(Mycoplasma)和植物支原体(植原体Phytoplasma)领域已有较为深入的研究，但是对于蜜蜂螺原体的研究却很少，研究力量十分薄弱。蜜蜂螺原体病严重制约着我国养蜂业的发展，急需对其进行深入研究来帮助减少其对养蜂业造成的损失。本课题将研究并分析螺原体侵染对蜜蜂免疫应答的影响，从而研究螺原体致病机理。研究结果将为蜜蜂养殖业防治爬蜂病病害提供理论基础。
5. 研究计划与进展
（四）研究计划及预期进展
1进度安排
2015年7月－2015年12月 养蜂场蜜蜂样品采集、处理；实验室饲养蜜蜂、处理；
