定殖方式对芘降解内生细菌在小麦体内定殖特性的影响开题报告

实验方案：

1.小麦土培试验

利用降解菌株PW7进行定殖研究，对其进行抗性标记，再将培养24h的抗性菌株配成菌悬液，采用适合于植物修复的浸种、涂叶、浸根等方法接种，采集植物样品的根、茎叶、培养液，消毒捣碎涂布，进行菌落计数，以及菌落形态和芘降解特性测定，以确定其为接种的菌株，即定殖成功。

1小麦温室盆栽试验采用温室盆栽法，以南京浦口农场距离土壤表面0~20cm的农田黄棕壤作为供试土壤。土壤样品风干后，过20目筛。

1.1芘污染土壤配置芘污染土壤的配置：称取1kg土壤用含有芘的丙酮溶液污染，添加无污染土壤，充分混匀，使得土壤中芘的最终浓度为50mgkg-1和100mgkg-1。待丙酮挥发后，将污染的土壤置于黑暗处老化30d后，进行盆栽实验。实验中共分为2个浓度和3种定殖方式（表1），每组设3个平行。同时设置添加等量丙酮的无污染土壤作为空白对照。

表1不同处理组

Table1Exposuregroups

1.2小麦浸染方法挑取抗性标记菌株PW7到LB抗性培养基中30℃、150rmin-1活化48h，配成OD600nm值为2.0的菌悬液，选择最常用的的适合于修复植物的三种定殖方式接种，即SR、SS、PL。（1）浸种接种：小麦种子经表面消毒，催芽、育苗48h后，用菌悬液浸泡6h，播种于污染土的盆钵中，作无污染土对照。

（2）土壤灌根接种：小麦种子经表面消毒，催芽、育苗48h后，待播种于污染土的盆钵中的小麦苗培养至株高约10cm左右，取10ml菌株悬液浇灌于各植物根部土壤。

（3）叶片涂叶接种：小麦种子经表面消毒，催芽、育苗48h后，待播种于污染土的盆钵中的小麦苗培养至株高约10cm左右，用无菌药棉蘸取菌株悬液，涂抹叶片，也可采取喷雾的方法接种。每个盆钵中含有320g土壤，种植13株幼苗生长。温室温度设置为白昼25/20℃，湿度为50%。培养过程中适量补充半强度的霍格兰营养液，维持土壤养分。分别于接种12d和16d后，收集植物根、茎。实验设置污染无菌土作为空白对照。实验中每个处理重复3次。

2小麦生物量测定将植物样品采集后，用无菌水充分冲洗植物表面，将植物样置于滤纸上吸除表面水分，最后用剪刀将植物根和茎叶分离，用分析天平分别称取植物根和茎叶的鲜重，即每瓶植物根和茎叶生物量。将新鲜植物冷冻干燥3d后，用分析天平分别称取植物根和茎叶的干重。

3小麦接种菌株数量测定称取一定重量的植物样品，无菌水冲洗干净植物表面，置于无菌操作台内用75%乙醇漂洗3~5min，再用无菌水清洗3~4次。将植株移入无菌研钵，加5mL无菌水充分研磨。取1mL上清液梯度稀释并涂布于芘降解固体培养基平板上，30℃恒温培养72h，待平板上长出菌落。计算细菌菌落数，每个处理设置3个重复。回收的菌株经菌落形态来确定其为接种的菌株，并计算每克鲜组织含菌量（CFU/g）。

4植物体内多环芳烃代谢酶的活性粗酶液的制备：称取植株地上和地下部分各0.1g，加入PVP（聚乙烯吡络烷酮）0.05g和pH=7.5的磷酸缓冲液（PBS）10mL，冰浴研磨，四层纱布过滤，后放入冰浴中超声破碎，12000rmin-1、4℃冷冻离心30min，取上清液(粗酶液)。酶活力测定：采用分光光度法，测定体系总体积为7.5ml，分别向玻璃比色杯中加入缓冲液6.0ml，20μmolL-1的邻苯二酚溶液1.0ml，粗酶液0.5ml。混匀后，37℃水浴反应，记录反应初始时375nm处的吸光值，反应30min后，测定反应液在该波长的光吸收增加值。酶活力单位(U)定义为：在标准测定条件下，每分钟内D375值变化0.001为1个酶活力单位(U)。

5小麦体内芘的提取与测定植物样品中芘浓度的测定方法参照文献[18~19]。具体方法：(1)样品经冷冻干燥后，研磨粉碎，取一定量置于30mL玻璃离心管中，用30mL的二氯甲烷和正己烷(V：V=1：1)溶液分3次，每次10mL超声萃取30min。(2)将萃取液收集后过无水硫酸钠柱-硅胶柱净化，用5mL的二氯甲烷和正己烷(V：V=1：1)洗脱。(3)洗脱液收集至旋转蒸发瓶40℃恒温浓缩至干，甲醇定容到2mL，过0.22μm孔径滤膜后，用高效液相色谱(HPLC)测定植物根和茎叶中芘含量，并计算芘浓度（mg/kg）、芘积累量（μg/pot）、植物体内富集系数与传导系数。植物富集系数是指植物根或茎叶中污染物含量（CRoot/CShoot,mg/kg）与水中污染物浓度（Cs,mg/L）的比值（以干重计），其大小反映了植物对污染物的富集能力的强弱，富集系数越大，富集能力越强[20]。其计算公式为：SCF=CShoot/Cs(1)RCF=CRoot/Cs(2)植物传导系数指茎叶富集系数与根中富集系数的比值[21]。TF值越大，污染物由根系向茎叶的传导能力越强。其计算公式为：TF=SCF/RCF=CShoot/CRoot(3)

6土壤中芘的提取与测定取2g制备好的土壤样品于30mL玻璃离心管中（湿土要先加入2g过20目筛的无水硫酸钠，充分混匀），加入10mL二氯甲烷，盖紧后，于超声水浴中超声萃取1h；以4000rmin-1离心10min;取3mL上清液过无水硫酸钠柱-硅胶柱净化,并用11mL1：1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脱；洗脱液收集至旋转蒸发瓶40℃恒温浓缩至干，甲醇定容到2mL，过0.22μm孔径滤膜后，用高效液相色谱(HPLC)定量分析，并计算芘浓度（mg/kg）。

7测定方法土壤中和植物体内芘浓度测定：测定采用定时整瓶提取培养基的方法[22~23]。向三角瓶加入等体积色谱甲醇，超声萃取混匀，静置后过0.22μm滤膜，用岛津高效液相色谱测定芘浓度。高效液相色谱设定参数为：InertsilODS-SP-C18反相色谱柱（150mm4.6mm,5μm），流动相甲醇：水=90:10，流速0.800mL/min，柱温40℃，检测波长245nm，进样量20μL。

可行性分析：

该研究有充足的理论基础支持，该课题所需的实验仪器及器材完备，实验材料可寻，实验操作方法清晰，具有较强的研究可行性。