1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
痕量元素，诸如as、cd、co、cu、cr、hg、mn、ni、pb、se 和 zn等是主要的环境污染物质[1]，主要来自于工业废水排放和农业杀虫剂等的使用。由他们造成的植物金属毒害正日益严重。
其中cu2 是一种植物生长发育过程中的必需元素，它参与了许多重要的代谢过程，对作物的发育、品质、产量有重要影响。但当作物过度暴露在cu2 中，主要由于过量使用含铜杀虫剂，会造成植物cu2 毒害。重金属的存在会影响植物体酶的活性，并导致生物膜脂过氧化[2]，生物膜通透性改变，离子失衡，从而影响植物生理。主要表现为植物生长受抑制，出现萎蔫或特殊的病变，过氧化物酶（pod）、过氧化氢酶（cat）活性升高、丙二醛（mda）含量增加等[3]。
为了抵抗重金属造成的毒害，植物自身在一定程度上有相应的防护措施。例如刺激产生金属螯合蛋白、通过液泡隔离重金属盐、离子区域化或产生特定的抗氧化酶以消除氧化伤害等[4-6]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
不同饱和度富氢水（hydrogen-rich water, hrw）外源处理对油菜铜胁迫缓解能力及造成的生理生化变化及机制。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
通过测定处理组合对照组的相关生理生化指标总结得出结论。
技术路线：
测定实验及对照组生理生化指标 |
得出结论 |
不同浓度Cu2 处理24 h，选取合适处理浓度 |
不同浓度富氢水处理12 h |
表型观察 |
Cu等元素含量测定 |
Hogland营养液培养均一的油菜苗 |
实验方法：
获得生长状况均一的苗：
油菜种子蒸馏水浸种4-5 h，用Hogland全元素营养液进行萌发，每天更换营养液，培养条件为25℃（上下浮动2℃），光周期固定16/8（光/暗）。培养7天获得长势较一致的苗。
Cu2 胁迫处理及H2处理：
1）获得最适Cu2 浓度：设定Cu2 浓度梯度为0、1、10、25、50和100（单位：μmol/l），用营养液配制，处理24 h，对比处理前后油菜苗根长变化，观察最适合的抑制浓度，选为终浓度。
2）H2处理：培养7天长势均一的油菜苗用终浓度Cu2 处理24 h，设定富氢水浓度梯度：0、1、25、50和100（% 体积比），处理12小时。
生理生化指标测定：
1）叶绿素含量：通过乙醇抽提叶绿素，在A470、A649、A665下分别测定吸光值计算叶绿素含量。
2）MDA含量：通过TBA/TCA法测定A532，A600下吸光值，测定MDA含量。
3）根干鲜重：称量新鲜油菜根样品和烘干后根样品重量。
4）根细胞膜脂伤害率：由于受到金属盐胁迫造成的过氧化会对植物细胞膜造成伤害，使膜穿孔，造成细胞内离子外漏，通过电导仪测得电导率，可以估计膜脂伤害率。
5）酶活性：测定抗氧化相关酶POD/SOD/CAT/APX酶活力。
⑴ POD： PBS（50 mM, pH=7.0）2.6 ml，愈创木酚（100 mM）300 μl, H2O2 (10%) 50 μl,与酶液50 μl迅速混匀，用分光光度计测定A470的光度值，计算得到POD活性。
⑵ CAT： H2O2(0.3%) 1 ml，H2O 1.75 ml 与酶液250 μl迅速混匀，用分光光度计测定A240的光度值，计算得到CAT活性。
⑶ APX： PBS（50 mM, pH=7.0）2.52 ml ，抗环血酸（2.5 mM）300 μl， H2O2 (1%) 30 μl与酶液150 μl迅速混匀，用分光光度计测定A290的光度值，计算得到APX活性。
⑷ SOD： 2.8 ml A液（PBS（50 mM, pH=7.8）200 ml，甲硫氨酸0.432 g，乙二胺四乙酸（EDTA） 0.006 g），1 ml B液（2 μM核黄素），1 ml C液（75 mM NBT）与150 μl酶样 混合，在光照箱中反应4.5 min后用分光光度计测定A560的光度值，计算得到SOD活性。其中不加酶样品避光作为空白对照，不加酶样品照光作为max。
6）元素含量测定：使用原子吸收光谱仪测定盐胁迫前后及H2处理前后植物根元素含量。测定前样品用微波消解仪消解，定容到25 ml。
7）组织染色：使用染色剂NBT测定H2O2或O2-。
可行性分析：
相关H2抗盐胁迫研究已有相关报道，有一定理论依据。各测定相关生理生化指标的方法均为简便易行通用的方法，且技术成熟，所用实验器材均可满足。
得出结论 |
不同浓度Cu2 处理24 h，选取合适处理浓度 |
不同浓度富氢水处理12 h |
表型观察 |
Cu等元素含量测定 |
Hogland营养液培养均一的油菜苗 |
实验方法：
获得生长状况均一的苗：
油菜种子蒸馏水浸种4-5 h，用Hogland全元素营养液进行萌发，每天更换营养液，培养条件为25℃（上下浮动2℃），光周期固定16/8（光/暗）。培养7天获得长势较一致的苗。
Cu2 胁迫处理及H2处理：
1）获得最适Cu2 浓度：设定Cu2 浓度梯度为0、1、10、25、50和100（单位：μmol/l），用营养液配制，处理24 h，对比处理前后油菜苗根长变化，观察最适合的抑制浓度，选为终浓度。
2）H2处理：培养7天长势均一的油菜苗用终浓度Cu2 处理24 h，设定富氢水浓度梯度：0、1、25、50和100（% 体积比），处理12小时。
生理生化指标测定：
1）叶绿素含量：通过乙醇抽提叶绿素，在A470、A649、A665下分别测定吸光值计算叶绿素含量。2）MDA含量：通过TBA/TCA法测定A532，A600下吸光值，测定MDA含量。
3）根干鲜重：称量新鲜油菜根样品和烘干后根样品重量。
4）根细胞膜脂伤害率：由于受到金属盐胁迫造成的过氧化会对植物细胞膜造成伤害，使膜穿孔，造成细胞内离子外漏，通过电导仪测得电导率，可以估计膜脂伤害率。
5）酶活性：测定抗氧化相关酶POD/SOD/CAT/APX酶活力。
⑴ POD： PBS（50 mM, pH=7.0）2.6 ml，愈创木酚（100 mM）300 μl, H2O2 (10%) 50 μl,与酶液50 μl迅速混匀，用分光光度计测定A470的光度值，计算得到POD活性。
⑵ CAT： H2O2(0.3%) 1 ml，H2O 1.75 ml 与酶液250 μl迅速混匀，用分光光度计测定A240的光度值，计算得到CAT活性。
⑶ APX： PBS（50 mM, pH=7.0）2.52 ml ，抗环血酸（2.5 mM）300 μl， H2O2 (1%) 30 μl与酶液150 μl迅速混匀，用分光光度计测定A290的光度值，计算得到APX活性。
⑷ SOD： 2.8 ml A液（PBS（50 mM, pH=7.8）200 ml，甲硫氨酸0.432 g，乙二胺四乙酸（EDTA） 0.006 g），1 ml B液（2 μM核黄素），1 ml C液（75 mM NBT）与150 μl酶样 混合，在光照箱中反应4.5 min后用分光光度计测定A560的光度值，计算得到SOD活性。其中不加酶样品避光作为空白对照，不加酶样品照光作为max。
6）元素含量测定：使用原子吸收光谱仪测定盐胁迫前后及H2处理前后植物根元素含量。测定前样品用微波消解仪消解，定容到25 ml。
7）组织染色：使用染色剂NBT测定H2O2或O2-。
可行性分析：
相关H2抗盐胁迫研究已有相关报道，有一定理论依据。各测定相关生理生化指标的方法均为简便易行通用的方法，且技术成熟，所用实验器材均可满足。4. 研究创新点
首次对H2对油菜抗Cu2 胁迫及初步机制进行探究。
5. 研究计划与进展
1） 十月完成培苗条件的摸索，实验仪器及方法的熟悉，探究最适cu2 胁迫浓度。
2） 至十一月中探索得到最适cu2 胁迫浓度。
3） 十二月至一月完成生理生化指标测定。
