1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义：
随着工业的发展和农业生产现代化的推进，大量的重金属污染物进入土壤环境，重金属污染日益严重[1]。重金属指比重大于4或5的金属，如镉、铜、铅、铁、锌、钴、锰等，重金属污染的特点有：①具有隐蔽性和滞后性②污染范围广，污染持续时间长③性质稳定，不可逆转④具有累积性[2]，故重金属污染对生态环境的破坏是极其严重的。重金属如cd、pd、cr、cu等可以通过食物链不断富集，进入人体，破坏正常的生理代谢活动，危害人类健康，而且有资料表明，我国因重金属污染而导致的经济损失至少200亿元，因此解决重金属污染问题迫在眉睫[3-4]。目前，修复重金属污染的方法有多种，可大致分为物理修复、化学修复和生物修复[2]，但物理化学修复不仅价格昂贵，难以大规模应用，而且常导致土壤结构破坏、肥力下降，降低土地的使用功能和应用价值，因此以成本低，不破坏土壤和河流生态环境、不引起二次污染等未能特点的植物修复技术正受到学术界的日益密切的关注表现出了广阔的市场前景[5-6]。随着分子生物学的快速发展，各种重金属转运蛋白在植物修复中起关键性作用，重金属转运蛋白分为吸收蛋白 (metal uptake proteins)和排出蛋白(metal efflux proteins)两大类[7]，它们在整个调控过程中发挥关键作用，参与了吸收、螯合、区室化和代谢利用等关键步骤[8-9]，有效对环境中的重金属进行吸收，转运和解毒。本次课题所研究的基因为重金属转运蛋白基因，且这些基因均有上游开放阅读框（uorf），上游开放阅读框（uorf）作为一个肽开关，对转运蛋白基因的翻译有促进[10]或抑制[11]的调控作用，可以使生物体面对各种胁迫环境增强适应力，维持其正常的生长发育[12]。本课题将从拟南芥中克隆锌转运体4前体、钙调神经磷酸酶类金属磷酸酯酶超家族蛋白等重金属转运蛋白基因，构建重金属转运蛋白基因的表达载体，在异源酵母功能互补实验的基础上，筛选其金属抗性，为解决重金属污染研究奠定基础。
国内外研究概况：
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
采用分子生物学方法，以拟南芥为材料，克隆锌转运体4前体、钙调神经磷酸酶类金属磷酸酯酶超家族蛋白等重金属转运蛋白基因，构建重金属转运蛋白基因的表达载体，在异源酵母功能互补实验的基础上，筛选重金属转运蛋白的金属抗性。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
本课题以拟南芥为实验材料，首先采用rt-pcr技术，提取拟南芥全长cdna，并以该cdna作为模板克隆锌转运体4前体、钙调神经磷酸酶类金属磷酸酯酶超家族蛋白等重金属转运蛋白基因；再通过构建目的基因的表达载体转化到酵母中进行异源酵母功能互补实验，从而对重金属转运蛋白的金属抗性进行筛选。
技术路线：
4. 研究创新点
（1）表达载体为pYES2质粒，pYES2的是一个5.9 kb的载体，设计用来在酿酒酵母中诱导表达重组蛋白。载体的特点在于基因插入载体的构建简单，以及能够使用原养型尿嘧啶进行转化株的筛选。
（2）上游开放阅读框（uORF）作为一个肽开关，对转运蛋白基因的翻译有促进或抑制的调控作用，可以使生物体面对各种胁迫环境增强适应力，但uORF对大编码框翻译的影响研究仅仅局限在很少一部分基因，本次课题克隆的重金属转运蛋白基因含有uORF，本次试验拟将克隆转运蛋白基因的CDS到yeast表达载体，研究其的金属抗性，具有一定的创新性。
5. 研究计划与进展
本项目预计在2014年9月到2015年4月内完成，预期进展情况如下：
（1）2014年9月：准备实验材料（ncbi网站上获得重金属转运蛋白基因的cds序列；rt-pcr技术，提取拟南芥全长cdna等）；
（2）2014年10月11月：克隆重金属转运蛋白基因；构建目的基因的表达载体；
