灵菌红素对K562细胞的增殖抑制和凋亡作用的研究毕业论文

论文总字数：15611字

摘 要

探究灵菌红素对K562细胞增殖以及凋亡的影响。 方法 通过不同浓度（0、100、200、500nmol/L）的灵菌红素处理K562细胞不同时间（24、48和72h），MTT法检测不同浓度灵菌红素处理不同时间对K562细胞增殖抑制的影响；运用流式细胞仪确定各组K562细胞在处理不同时间（24和48h）的凋亡率。 结果 MTT的结果表明，相比对照组，3组实验组中灵菌红素剂量依赖的表现出了对K562细胞的增殖抑制作用，其中处理72h后100、200和500nmol/L组的细胞相对增殖率分别为72.58%、42.47%和23.23%；凋亡实验结果表明灵菌红素处理增加了K562细胞的凋亡率，且占比远高于细胞坏死，其中处理48h后，500nmol/L组的K562细胞凋亡率达到7.17%，为对照组的6.13倍。 结论 本研究结果提示灵菌红素可以剂量依赖的通过增加K562细胞的凋亡达到增殖抑制作用。

关键词：灵菌红素，K562细胞，凋亡，抗肿瘤

Study on effect of prodigiosin on proliferation inhibition and apoptosis of K562 cells

Abstract: Objective: To evaluate the effects of prodigiosin on the proliferation and apoptosis of K562 cell line. Methods: K562 cells were treated with different concentrations (0,100,200,500nmol / L) of prodigiosin at different time (24,48 and 72h),then MTT assay was used to detect the proliferation of K562 cells; The apoptosis rate of K562 cells was determined by flow cytometry at different time (24 and 48 h). RESULTS: The results of MTT assay showed that the inhibitory effect on the proliferation of K562 cells was observed in the three groups compared with the control group. After being treated 72h, the relative proliferation rates of cells in the 100, 200 and 500 nmol / L groups were 72.58%, 42.47% and 23.23%, respectively. The results of apoptosis test showed that the treatment of prodigiosin dose-dependent increased the apoptosis rate of K562 cells. For the 500 nmol/L group, apoptosis rate was 7.17% when the cells were treated 48h, which was 6.13 times of the control group. Conclusion: The results of this study suggest that the prodigiosin can be dose-dependent increase the apoptosis of K562 cells to achieve the effect of proliferation inhibition.

Key words: prodigiosin, K562 cell line, apoptosis, anti –cancer

1 引言

慢性髓细胞白血病（chronic myelocytic leukemia CML）也称为慢性粒细胞性白血病，是一种以粒细胞系不典型增生为主要表现的骨髓增生性疾病，1854年由Gragie 等^[1]首次报道发现。在世界范围内其年发病率为1-1.5/10万^[2]。在美国，其慢性髓细胞白血病中位诊断年龄为64岁，年龄调整发病率为1.6/（10万人年）^[3]。在我国年发病率比西方国家要低，为0.39-0.99/10万，但45-50岁的中位发病年龄比西方国家要年轻^[4]。

灵菌红素是一类具有三吡咯环骨架的天然色素的总称，1929年由Amak等首次报道发现，现在已知的灵菌红素主要包括灵菌红素（prodigiosin，PG）、间环丙菌素（metacycloprodigiosin，MPG）、环丙烷灵菌红素（cycloprodigiosin，CPG）、壬烷基灵菌红素（nonylprodigiosin，NPG）和十一烷基灵菌红素（undecylprodigiosin，UPG）等^[5]。上世纪60年代灵菌红素就被当作抗生素和细胞毒性剂而研究，但是由于它们的高细胞毒性而没有在临床上开发^[6]。近十几年来人们又对灵菌红素抗肿瘤的能力进行了研究^[7-9]，发现其对超过六十种肿瘤细胞系都有明显的抑制生长作用，其平均半数抑制浓度仅为2.1uMol·L^{-1[6, 10]}，而此浓度下无法体现对正常细胞的生长的抑制作用^{[11, 12]}，表现出了作为新型抗肿瘤药物的巨大潜力。

具体来说，Montaner等^[13]就报道灵菌红素对造血癌细胞系Jurkat，NSO，HL-60和Ramos具有细胞毒作用，并实验证明了灵菌红素发挥细胞毒作用的机制是诱导细胞凋亡。此后motaner等^[14]又报道了灵菌红素诱导结肠癌细胞凋亡。Diaz-Ruiz, C等^[12]通过MTT法发现灵菌红素可以诱导胃癌细胞系（HGT-1）红藻毒素诱导细胞皱缩，染色质凝聚以及肌动蛋白微丝结构的重组并最终引起细胞凋亡。Soto-Cerrato, V等^[15]于2004年报道灵菌红素诱导人乳腺癌细胞凋亡，证明PG在雌激素受体阳性（MCF-7）和阴性（MDA-MB-231）乳腺癌细胞系中都具有有效的细胞毒性。并通过测定细胞色素c、半胱氨酸蛋白酶9、8和7的变化推测其可能通过线粒体途径发挥作用。沈亚领等^[5]使用MTT法探究了灵菌红素对人胰腺癌8898细胞增殖抑制的药效学作用，发现灵菌红素5mg·L^-1的培养液中8898细胞出现凋亡早期的形态学特征 ，IC50为 30mg·L^-1；并通过测定细胞中DNA含量推测灵菌红素抑制细胞的增殖 ,与抑制S期细胞的DNA复制及调控细胞的增殖周期相关。Llagostera等^[16]研究了灵菌红素对两个小细胞肺癌细胞系，GLC4和其衍生的多柔比星抗性GLC4 / ADR细胞系的增殖抑制作用，结果显示灵菌红素处理后细胞内毒性蛋白的表达增加并且呈剂量依赖的导致细胞凋亡。Liu等^[17]通过分离纯化Mycale plumose派生的放线菌的发酵肉汤得到了MPG以及UPG，并首次报道了MPG对P388，HL60，A-549，BEL-7402和SPCA4等人癌细胞系表现出显着的细胞毒活性。而El-Bondkly^[18]等从埃及海洋放线菌中纯化出了灵菌红素并证明了它对三种人类癌细胞系（结肠癌细胞系（HCT-116）、肝癌细胞系（HEPG-2）和乳腺癌细胞系（MCF-7）具有明显的细胞毒性。

除了抑制肿瘤细胞增殖，Wang等^[19]成功构建动物模型，证明灵菌红素可以对移植到裸鼠体内的肿瘤组织起到明显的抑制作用。此外，多组研究也表明灵菌红素可以有效抵抗癌细胞的浸润转移^[20-22]。

尽管对灵菌红素的研究已经有很多，但灵菌红素抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡的内在机理目前不是很清楚[23]，所以相关的解释有很多。Melvin等^[25]认为富电子的灵菌红素类物质通过氧化来还原Cu（II）以诱导双链DNA裂解，从而发挥其细胞毒性作用。而Montaner^[26]等通过测定体外培养细胞拓扑异构酶I和II活性以及铜离子介导的切割活性的影响因素确定DNA是灵菌红素的作用靶点。此前他们也证明了灵菌红素通过P38-MAPK的磷酸化而不是SAPK/JNK的磷酸化诱导Jurkat细胞的凋亡^[27]。另一种灵菌红素衍生物所诱导的细胞凋亡则是通过应激激活蛋白激酶SAPK/JNK的活化而起作用的，并能活化capase，上调Fas配体的表达^[28]。而Pan等^[29]研究发现灵菌红素通过JNK抑制上调了内质网应激标志物CHOP，并反过来导致BCL2表达的下调，最终诱导PARP裂解促进细胞凋亡。Soto-Cerrato等^[30]研究发现灵菌红素能介导GSK-3β的活化，发挥诱导细胞凋亡的抗肿瘤作用，其中GSK-3β的激活是通过抑制PI3K/AKT途径实现。Wang等^[19]进一步研究发现通过减少GSK-3β、LRP6、DVL2的磷酸化，灵菌红素可以降低Wnt信号通路的信号传导和细胞周期蛋白的表达。Marchal等^[31]利用合成的灵菌红素类似物证明其可以通过自身的质子化最终改变细胞内pH。进一步研究发现当灵菌红素在低浓度时（lt;100nM），能可逆的引起pH的改变，而不引起细胞的凋亡；在高浓度时（gt;500 nM），能引起不可逆的细胞凋亡^[33]。

肿瘤发生通常与p53的缺陷有关，这种蛋白的基因在大多数人类癌症中经常突变，且与不良预后有关^[34]，而Ramin等^[35]研究发现灵菌红素可以诱导p53缺陷的HT-29细胞发生凋亡，说明灵菌红素诱导细胞凋亡的机制独立于p53和DNA损伤，且其诱导细胞凋亡的机制可能与细胞内caspase3的激活有关。但是Hong, B等^[36]研究发现p53缺陷的肿瘤细胞能够被灵菌红素诱导凋亡可能与另一p53家族的蛋白质p73表达的上调有关。尽管对p53家族在灵菌红素诱导肿瘤细胞凋亡的可能性上存在争议，但多个研究都表明灵菌红素的诱导凋亡能力与caspase的激活有关^{[15, 37, 38]}。

以上所涉及研究都说明灵菌红素确实对多种肿瘤细胞系具有明显的增殖抑制作用，且其可以通过多种信号通路诱导细胞凋亡，表明其确实有被开发成药物的潜力。鉴于目前未见灵菌红素对K562细胞的作用的报道，所以本研究旨在探究灵菌红素是否通过增加K562细胞的凋亡来对K562细胞产生增殖抑制作用，以填补相关研究的空白。

2 材料与方法

2.1 主要仪器与试剂

灵菌红素（ab144331，abcam，美国）；IMDM培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（FBS，Gibco，美国）；四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma，美国）；二甲基亚砜（Sigma，美国）；Annexin V-FIFC/PI凋亡试剂盒（碧云天，江苏）；倒置荧光显微镜（Olympus，日本）； Aria Ⅱ流式细胞仪（BD，美国）；二氧化碳培养箱（Thermo Scientific，美国）；台式多用途离心机（Thermo Scientific，美国）；小型高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）。

2.2 细胞系与培养条件

人慢性髓系白血病细胞 K562 细胞（购自中科院上海细胞库），并用含10%（v/v）的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和青霉素100（U / ml）/链霉素100（U/ml）IMDM培养基中，培养温度为37℃，CO₂浓度5%。

2.3 灵菌红素溶液配制

灵菌红素溶于二甲基亚砜（DMSO）制得2mg/L的储备液，超纯水稀释至10ug/L标准储备液，-20℃避光保存，每次实验前按实验要求使用培养基和标准储备液梯度稀释得到含灵菌红素浓度为100nmol/L，200 nmol/L，500 nmol/L的培养基。并配制含灵菌红素浓度为0的培养基作为空白对照组。

2.4 细胞增殖抑制测定

用配制好的灵菌红素培养基将对数生长期的K562细胞稀释到5×10⁴个/mL，取200uL于96孔板中得到含有562细胞1×10⁴个/孔的96孔板，同时设置培养基对照组，每组6个平行样；适宜条件培养，并于接种后24h，48h和72h，通过使用MTT法来测定细胞的增殖抑制情况。其中MTT法的具体操作为在每个确定的培养周期之后，加入20uL的MTT溶液，继续培育4h后，离心，去除孔内培养基后，加入150uLDMSO以溶解孔内的MTT晶体，使用微板读数器在490nm处测定每孔的吸光度，扣除培养基对照的数值，结果表示为空白对照的百分比。实验在不同时间重复3次。

2.5 凋亡的测定

使用配置好的灵菌红素培养基将对数生长期的K562细胞稀释到1×10⁵个/mL，3mL每孔接种到6孔板，同时设置空白对照组，每组3个平行样；适宜条件培养24h和48h后收集细胞，PBS缓冲溶液清洗2次后加入200uL Binding buffer重悬细胞，加入5uL的Annexin V-FIFC避光染色15分钟后加入PI染液，流式细胞仪测定细胞凋亡率。实验在不同时间重复3次。

2.6 统计分析

实验结果用SPSS 18.0进行统计分析，数据用均数±标准差（X±S_D）表示，各染毒组与对照组间均数比较采用独立样本t检验分析，各组间差异采用单因素方差分析，plt;0.05 视为具有统计学差异。

3 结果与讨论

3.1 灵菌红素对K562细胞增殖抑制的影响

在培养24h之后，对比空白对照组，500 nmol/L组培养基中出现明显的细胞碎片，且100nmol/L、200 nmol/L两组培养基中也可以看见不同程度的细胞变形以及细胞皱缩。如下图1所示，灵菌红素对K10562细胞的增殖抑制与灵菌红素的浓度有关，呈现明显的剂量依赖，同一时间维度下，高浓度灵菌红素处理组具有更低的相对增殖率；而随着时间的延长，各组相对增殖率也出现继续的下降，表明灵菌红素的增殖抑制作用随时间加强；而统计学分析也显示对于同一浓度灵菌红素染毒组来说，其相对增殖率随时间的变化存在显著性差异（Plt;0.05），表明存在时间效应关系。如表1所示，灵菌红素处理K562细胞72h后，100、200、500nmol/L浓度组的相对增殖率分别为72.58%、42.47%和23.23%。而单因素方差分析结果也显示灵菌红素处理48h和72h后，各组细胞的相对增殖率随灵菌红素浓度的增加而显著下降（Plt;0.05）表明存在计量效应关系。

图1 不同浓度灵菌红素染毒不同时间对K562细胞增殖率的影响

表1 灵菌红素处理K562细胞的相对增值率表（X±S_D）%

		灵菌红素浓度（nmol/L）
		0	100	200	500
染毒时间	24h	100±3.84	94.76±4.36	82.67±1.97*	72.58±2.52*
	48h	100±4.02	88.35±3.64*	59.73±3.43*	42.47±3.76*
	72h	100±2.83	88.22±2.78*	52.61±3.46*	23.23±0.92*

[注]*：与对照组相比结果具有显著性差异（Plt;0.05）

3.2 灵菌红素对K562细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测不同浓度灵菌红素处理K562细胞不同时间的凋亡率的结果显示，随着灵菌红素浓度的增加，早期凋亡细胞的数目明显增多，细胞的凋亡率也随之增加，呈现一定程度的量效关系（图2，图3）。对同一浓度染毒组来看，处理48h后，细胞的早期凋亡率也明显增加，其中以500nmol/L组增加最为明显。具体来看，处理24h后，各组细胞的早期凋亡率分别为1.10%、1.56%、1.73%和3.50%（表1），其中200和500nmol/L组的结果具有统计学差异（Plt;0.05），表明灵菌红素处理可以增加K562细胞的凋亡率。处理48h的结果与24h的结果一致，且500nmol/L组的K562细胞早期凋亡率达到7.17%，为对照组的6.13倍说明灵菌红素处理导致了K562细胞发生凋亡。

B

A

D

C

（A：0nmol/L；B:100nmol/L；C:200nmol/L；D：500nmol/L）

图2 不同浓度灵菌红素处理K562细胞24h对细胞凋亡的影响

B

A

C

D

（A：0nmol/L；B:100nmol/L；C:200nmol/L；D：500nmol/L）

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：15611字