环境中戈登氏菌的培养和代谢产物分析开题报告

 2021-12-10 17:47:15

1. 研究目的与意义（文献综述）

类胡萝卜素(Carotenoid)是一类呈黄色、橙红色或红色的多烯类化合物。自然界中存在着600多种类胡萝卜素,其中的50多种具有维生素A原的活性。其中以β-胡萝卜素(Beta-carotene,Bc)作为维生素A原的活性最强,被认为是人体获得必需的维生素A的重要来源。目前,Bc已被作为食品添加剂和营养增补剂,在全世界广泛使用[1]。天然类胡萝卜素有很好的抗癌作用[2]。天然产物提取的类胡萝卜素具有极高的生物活性,但是受地域、原料和得率等种种因素限制而无法大规模生产;微生物发酵法因不受环境等条件的影响,而具有成本低,工艺简单,质量稳定等优势。

目前已发现的产类胡萝卜素的菌株主要为光合细菌,霉菌,酵母和藻类[3,4]。其中光和细菌需要光照,不适合发酵罐大量培养;霉菌中如运用较普遍的三孢布拉霉菌,由于其丝状真菌的特点导致其发酵调控工艺较为复杂;酵母如红酵母生产类胡萝卜素的产量相对较低；而藻类由于受产地和季节的限制，而无法大规模推广。而放线菌生产类胡萝卜素相对于酵母,光和细菌有其独特的优势。

放线菌中的戈登氏菌可以产类胡萝卜素[5]。戈登氏菌是一类好氧生长、不游动、轻度抗酸的革兰氏阳性菌，G C含量大约为64%~69%。细胞形态分化简单，不产生气生菌丝和孢子丝。戈登氏菌分布较为广泛，有的寄生于人体之中，有的则生存于各种自然环境中，如：土壤、污水、油井等。该菌菌体不为丝状且发酵产类胡萝卜素产量较酵母高，为了,本文通过单因素实验找出戈登氏菌最适培养条件，通过微生物代谢产物的纯化分离技术，从戈登氏菌菌株培养液中分离出待研究的类胡萝卜素，研究在不同培养基培养下菌种代谢产物的不同，并对代谢产物进行分析，这对戈登氏菌的培养和进一步提高其产类胡萝卜素的产量具有重要的应用意义。

戈登氏菌（Gordonia）最早是被Tsukamura于1971年发现并提出的[6]，存在于肺病患者的痰中和土壤中的耐酸性较弱的生物，命名为Gordonabronchialis。之后国内外便不断地有研究者发现戈登氏菌属的新菌种，并进行特性及基因组分析等。国内外有关戈登氏菌产类胡萝卜素的研究也逐渐增加。

2011年，何然、王永泽、王金华等[7]对一株产类胡萝卜素戈登氏菌的发酵培养基进行了研究。采用单因素设计的方法筛选最适宜发酵产类胡萝卜素的氮源、碳源,采用Plackett-Burman设计筛选出对发酵产胡萝卜有重要影响的无机盐类。并得出结果，该戈登氏菌发酵产类胡萝卜素最适碳源为蔗糖,最适氮源为KNO3。MgSO4,FeSO4这两种无机盐对菌株产类胡萝卜素具有显著性的影响。最终确定发酵培养基为:蔗糖20g/L,硝酸钾4g/L, MgSO4 0.4g/L, FeSO4 15mg/L, KH2PO4 2g/L, Na2HPO4 3g/L, 柠檬酸钠2g/L。用此培养基,戈登氏菌产类胡萝卜的量可达到600.5mg/L,比最初所选用的培养基提高了212.5%。

后续何等[8]对一株产类胡萝卜素的放线菌菌株进行鉴定,优化其产类胡萝卜素的培养基和发酵条件,并对发酵后菌液的匀浆破胞工艺进行了研究。首先,通过16SrDNA测序和生理生化鉴定的方法，并结合该菌的生理生化实验初步鉴定确定该菌株为大西洋戈登氏菌（gordoniaalkanivorans），并对其生物特性进行了研究。然后对该株戈登氏菌产类胡萝卜素的发酵培养基和培养条件进行研究，得到最佳发酵条件为:发酵温度为28℃,发酵液的初始pH值为7.5,摇床转速为220r/min。最后,对菌体进行高压匀浆破胞研究。发现在高压匀浆破碎戈登氏菌体细胞过程中,匀浆压力、匀浆次数及悬浮液体系是主要影响破胞主要因素。通过实验确定了菌体细胞高压匀浆破碎的工艺:进料菌液密度为60g/L左右,用磷酸缓冲液悬浮,悬浮液与菌液比例为1:1,在200MPa压力,匀浆次数为一次,匀浆过程中温度控制为4℃以下。

李等[9]对出发菌株HBUTY进行诱变育种，以增加其类胡萝卜素产量。确定了紫外和亚硝基胍复合的诱变条件为：紫外照射6min,1.0g/L的亚硝基胍。同时确定了二苯胺筛选平板的浓度为500ug/L，选出四株菌株的色素产量较未诱变前增加了22%-25%，并且具有良好的遗传稳定性,表明对戈登氏菌的复合诱变有效。对戈登氏菌的破胞工艺和提取溶剂进行选择并采用L9（34）正交设计方法对该菌的色素提取进行优化，同时对纯化条件进行初步研究。确定细菌的破胞方法采用超声波破胞法，提取溶剂为二甲基亚砜，提取时间1h，提取温度25℃，料液比为1:20，提取3次，提取出色素291mg/L。柱层析的洗脱剂为石油醚、丙酮和乙醇梯度洗脱，对色素产物进行初步分离纯化，得到组分Ⅰ与Ⅱ，组分Ⅱ中含有目的色素。通过高效制备色谱仪对组分Ⅱ进一步分离纯化，并且用液相色谱对其进行纯度检测，达到了95%。对纯化色素产物进行初步的结构鉴定，通过紫外图谱，化学官能团测试，红外图谱，液相质谱分析该色素为多烯烃类胡萝卜色素，与文献中番茄黄质数据一致，判断其为番茄黄素类似物。最后对类胡萝卜素稳定性进行条件进行了研究。温度对色素稳定性影响较大，高温下色素会迅速氧化，4℃适宜色素的储存。酸性条件下对类胡萝卜素的稳定性有破坏作用，pH为9.0时适宜色素的储存。氧化剂和还原剂都对类胡萝卜素有一定的破坏作用，K 、Na 、Ca2 、Mg2 、Cu2 、Zn2 、Fe3 对色素稳定性起到一定的保护做用，Fe2 能够使色素大量氧化，应该避免与其接触。

Harshada Sowani等[10]从受碳氢化合物污染的热带土壤样品中富集了戈登氏菌HS-11菌株。发现该生物可对角鲨烯和正十六烷进行生物降解，同时形成生物表面活性剂和类胡萝卜素。Kai-Wen Lee等[11]提出，使用酒精/盐水溶液双相系统对戈登氏菌细胞进行综合提取破坏，来直接回收类胡萝卜素。微生物类胡萝卜素过程中通常受到生产成本高和多步单元操作的限制。研究中提到由酒精和盐组成的双相水相系统（ABS）或可作为克服这些限制的潜在方法。通过评估相形成成分的浓度，pH，粗负载量，添加剂的浓度，超声处理时间对类胡萝卜素回收率的影响，开发了用于细胞破坏和同时回收类胡萝卜素的最佳ABS。最后得出高含水量和高成本效益的ABS使得在戈登氏菌发酵的过程中提取和分离类胡萝卜素一体化成为可能的结论。

2. 研究的基本内容与方案

基本内容

（1）掌握戈登氏菌R15菌株纯培养的常用技术方法 。

（2）掌握戈登氏菌R15菌株生长特性的研究方法和分析手段。

（3）对戈登氏菌R15菌株生长特征进行研究，得到最适培养基和培养条件。

（4）对戈登氏菌R15菌株代谢产物进行纯化并分析产物特征。

（5）通过对使用不同培养基的代谢产物分析对可能出现在吸收光谱中的双峰变化现象进行解释。

（6）分析整理实验数据，完成论文撰写。

目标

本研究的主要对象是实验室中的戈登氏菌R15菌株的生长特性以及其代谢过程的产物，目标是通过单因素实验找出最适培养条件，掌握微生物代谢产物的纯化分离技术，从R15菌株培养液中分离出待研究的类胡萝卜素，研究在不同培养基培养下菌种代谢产物的不同，并对代谢产物进行紫外分光光度、全光谱扫描分析、红外光谱等分析，观察是否有双肩峰，及其不同条件下的变化。

技术方案及措施

1.首先分离纯化得到的戈登氏菌菌种。按配方配置固体PR培养基，倒平板。待平板冷却并在适宜条件下的恒温箱中培养确认无杂菌生长后，取出冷藏的菌株，采用平板划线法接种到固体培养基上。

2.观察菌落形态特征，研究其生理生化特性。在适宜条件下放入恒温箱中培养，待其长出单菌落，挑取单菌落，并观察记录菌落形态特征。依此方法重复培养三次，完成菌株的活化。

3. 使用单一因素法探究戈登氏菌R15菌株的生长条件，筛选出主要影响因素，通过培养条件的正交试验确定最适生长条件。制备菌悬液，在锥形瓶中加入适量液体PR培养基，在121℃灭菌20min，冷却至室温。使用接种环，挑取一满环活化的菌种接种到液体培育基中，于30℃、100rpm摇床中培育24h。再配制培养基、无菌操作台上移取菌悬液于锥形瓶中接种。将锥形瓶分别30℃、100rpm的恒温摇床中培养72h。使用单一因素法以培养温度因素、接种量因素、pH因素、溶解氧量因素为主要因素展开实验，探究不同条件下菌株的生长情况，通过培养条件的正交试验，确定最优培养条件组合。

4. 得到最适条件下的生长曲线。在最适条件下，如上制备菌悬液、配置培养基并接种，然后进行培养，然后定时测量并记录OD600数值，得到最适条件下的生长曲线

5.对代谢产物纯化分离，得到其吸收光谱和红外光谱，分析产物特征。首先制备干菌体，将之前培养72h后的菌悬液在8000r/min下离心6min，弃掉上层清液，用超纯水洗涤1次，4000r/min离心20min，弃上清液，将沉淀物置于60℃烘箱中烘干得干菌体。使用KBr压片法测定干菌体的红外光谱。之后使用酸热法破坏细胞壁。取2g干菌体放于50mL离心管中，加入3mol/L的浓盐酸30mL，浸泡40min。浸泡完毕后于沸水浴中加热4min，再置于冰水混合液中降温至0℃，4000r/min离心20min，用超纯水洗涤2次，弃上清液即得到细胞碎片。然后进行色素提取液的制备：向细胞碎片中加入丙酮和石油醚的1：1混合液作为提取剂，浸泡30min后4000r/min离心20min，收集上清液，即为色素提取液。对色素提取液和1：1丙酮-石油醚混合液进行全波长扫描，设置波长范围为190-900nm。

6.比较使用不同培养基的代谢产物和产量，确定最适培养基。

7.通过微生物的16S rRNA PCR扩增方法，并与数据库对比确定菌种种属。

3. 研究计划与安排

第1~3周：确定选题方向，查阅与课题有关的资料并对所收集的资料进行整理,

明确研究内容，了解与确定研究方案，撰写并完成开题报告。

第4~6周:查阅相关资料进行理论学习与课题基础研究。

第7~9周:进行土壤采样，分离培养戈登氏菌菌株。

第10~12周：对戈登氏菌的代谢产物进行实验分析。

第13~14周：熟读高度相关的文献资料，根据实际实验数据撰写论文。

第15周：论文修改与完善，准备答辩。

4. 参考文献（12篇以上）

[1] 王庆伟．类胡萝素的研究进展与临床应用[J]．中国药事，2000，14(1)：58-60．

[2] Singh P，Goyal GK．Comprehensive Reviews inFood Science and Food Safety[J]．

Journalof Applied Microbiology，2008，7：255-256.

[3] Qiu-BaoSheng，LiuQifang．ActaHydrobiologicaSinica，2000，24(5)：546-554

[4] SchmidtDC．Engineeringnovelcarotenoidsinmicroorganisms[J]．Current

OpinioninBiotechnology，2000，11(3)：255-261.

[5] ShinichiTakaichi，TakashiMaoka，NaoshigeAkimoto，eta1．Carotenoidsina

Corynebacterineae，gordoniaterraeAIST-1：CarotenoidsGlucosylMycoloylEsters[J]．Biotechnology，2008，72(10)，2615-2622．

[6] TSUKAMURA, M. Proposal of a NewGenus, Gordona, for Slightly Acid-fast

OrganismsOccurring in Sputa of Patients With Pulmonary Disease and in Soil[J].

Journal of General Microbiology,1971, 68(1):15-26.

[7] 何然，王永泽，王金华. 戈登氏菌发酵产类胡萝卜素培养条件研究[J]. 食品与发酵科技. 2010,47(1):42-45.

[8] 何然. 一株戈登氏菌的鉴定及其发酵产类胡萝卜素工艺优化[D].湖北工业大

学,2011.

[9] 李超.一株产类胡萝卜素戈登氏菌的诱变及其色素产物的研究[D].湖北工业大学,2013.

[10] Harshada Sowani.Biodegradationof squalene and n- hexadecane by Gordonia amicalis HS-11 with concomitantformation of biosurfactant and carotenoids[J]. International Biodeterioration Biodegradation.2019,142(1):172-181.

[11]Kai-Wen Lee.Integrated extractive disruption of Gordonia terrae cells withdirect recovery of carotenoids using alcohol/salt aqueous biphasic system[J].Separationand Purification Technology.2019,223(15):107-112.

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