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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、课题的意义、国内外研究进展、应用前景等
1.研究意义：
在石油的开采、加工和利用过程中，越来越多的石油可能会进入土壤环境从而引起土壤环境的污染和破坏。据统计，我国约有 60 万吨石油进入环境当中，对生态环境造成严重的破坏。有研究表明，中国的大型油田区和石油化工生产区土壤中的石油烃含量可能高达 50g/kg~94g/kg，污染更为严重[1]。过量的tph一旦进入土壤将很难予以排除，将给社会、经济和人类造成严重的危害。
2. 研究的基本内容和问题
二、研究的目标、内容和拟解决的关键问题
1.研究目标：
拟研究菌株yj3对土壤石油烃的降解性能以及降解性能优化研究。结果可为土壤中石油类污染的生物修复提供环境适应性强、降解效果好的微生物菌种资源。
3. 研究的方法与方案
三、研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
1、研究方法：
1.1石油烃降解能力测定方法:
1.1.1采样时间：2019.3.10
1.1.2石油烃测定方法：
紫外分光光度法测定土壤石油烃含量：选取所需柱子,每根柱子先加入2g硅胶，再加入2g无水硫酸钠，每杯烧杯中取2g实验土壤加入小瓶，再加入20ml二氯甲烷，超声，取上清液过柱子，重复一次，最后加入5ml二氯甲烷，吹脱至烧瓶，旋转蒸发，加入3ml二氯甲烷，于紫外分光光度计测量吸光度，对比标准曲线换算出相应浓度。
1.2酶活性测定方法：
1.2.1过氧化氢酶测定方法：
A．试剂配制：1%邻苯二酚溶液、乙醚、重铬酸钾标准溶液—0.75gK2Cr2O7溶于1L0.5HCl（相当于50ml醚中含5mg紫色没食子酸）、pH4.5—磷酸缓冲液
B．标准曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液用0.5NHCl稀释成各种不同浓度。定容后，在分光光度计于430nm处比色测定，以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。
C．操作步骤：取1g土样（过0.25mm筛），置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温箱培养2h。取出后加4mlpH4.5柠檬酸—磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30mim。最后，将含溶解的紫色没食子酸的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片，为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食子酸的纯度，需设无机质的土壤和无土壤的基质作对照。
D．活性表示：紫色没食子酸的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知
1.2.2脱氢酶活性测定方法:
A．以土壤有机质作为氢的供体或用葡萄糖作氢的供体，用生成的甲醛数量或换算成氢的体积表示脱氢酶活性。
B．试剂配制：1%三苯基四氮锉氯化物溶液、CaCO3、甲醇、甲醇的标准溶液:用三苯基四锉氯化物还原配制。吸取10ml分别含20—300微克的溶液，加10mgNaHSO3还原，显色后在分光光度计上于460nm处比色测定并绘制标准曲线。
C.操作步骤：取20g土壤置于50ml三角瓶中，加0.2gCaCO3。混匀后加2ml1%三苯基四措氯化物，再加水至最大持水量的90%。在恒温恒湿培养箱中（30度，相对湿度70%）培养24h。培养结束后，加25ml甲醇，振荡5min，过滤。再用甲醇多次洗涤漏斗上的土壤，直至获得无色滤液。合并滤液和洗液并定容50ml或100ml，在分光光度计上于460nm处比色。
D．酶活性表示并计算：脱氢酶活性，以20g土壤中H 的微升数表示。
X=av*150.35
2.技术路线：
3.实验方案：
菌株对不同浓度石油烃的降解速率及复合肥对菌株降解石油烃的影响：
实验材料：菌株YJ3,干净土壤，石油烃
实验试剂及药物：新鲜Lb抗性培养基、msm培养液、霍格兰营养液、磷酸盐缓冲液，Lb抗性培养基（100ml）：1.5g琼脂粉、1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g氯化钠；（高温灭菌后待降温到手可触摸的55℃时加入amp）amp最终浓度100μgml
实验设计的浓度：1000mg/kg，5000mg/kg
环境条件：复合肥的施用
培养温度：25
土壤田间持水量：26.7%
实验处理组设计：
实验分多个处理组，每个处理组三个平行。
| 不同处理组 | 石油烃浓度（mg/kg） | 复合肥施用 | 菌株YJ3 |
| C1000，P | 1000 |
|
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| C1000 | 1000 |
| - |
| C5000，P | 5000 |
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| C5000 | 5000 |
| - |
| C1000，S，P | 1000 |
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| C1000，S | 1000 |
| - |
| C5000，S，P | 5000 |
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| C50000，S | 5000 |
| - |
菌悬液制备: 将菌株HY接种到新鲜LB抗性培养基中150 r·min-1、30℃摇床培养24 h，6000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，加入灭菌的MSM使菌体混合均匀，再次离心，洗涤2~3次，最后用MSM调整菌悬液的OD600nm值为1.0(菌落数约为8.77g CFU·mL-1) ，4℃保存备用。
石油烃浓度对降解菌体内石油烃降解酶活影响
酶活选择：过氧化氢酶，脱氢酶
分析意义：过氧化氢酶广泛存在于土壤中和生物体内。土壤过氧化氢酶过氧化氢酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用。过氧化氢酶活性与土壤有机质含量有关，与微生物数量也有关。脱氢酶是生物体产生的一种蛋白质，能促进有机物脱氢，从而使石油烃的氢原子活化并传递给特定的受氢体，实现石油烃的氧化和转化。微生物对石油污染物的降解或转化从脱氢开始，因此，可利用脱氢酶的活性反映石油降解微生物的活性，进而评价其对石油烃的降解。
实验处理组设计：
实验分多个处理组，每个处理组三个平行
| 不同处理组 | 酶活测定 | 菌株YJ3 |
| C5000，P，过氧化氢 | 过氧化氢 |
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| C5000，过氧化氢 | 过氧化氢 | - |
| C5000，P，脱氢 | 脱氢 |
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| C5000，脱氢 | 脱氢 | - |
4. 研究创新点
四、特色或创新之处
通过已经筛选好的菌株了解该菌株在不同条件下对石油烃的降解情况，为解决土壤石油烃污染提供了数据支撑和科学依据。
5. 研究计划与进展
五、研究计划及预期进展
2019.2-2019.3
进行实验初期准备：选取污染土壤，施加相应环境条件
