Fe0/Na2S2O8去除水体中多重耐药菌及耐药基因的效果及机制开题报告

 2022-01-17 09:01

全文总字数:9854字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)

1.选题意义

抗生素是一把典型的双刃剑,在拯救生命的同时,滥用抗生素会刺激细菌的进化和耐药性的传播[2]。随着具有多重耐药性能的“超级细菌”的不断产生与传播,世界各国只会面临更严峻的挑战,这些超级细菌可以同时表现出对多种抗生素的耐药性[3]。而这些趋势意味着人类将进入抗生素后时代,就像抗生素出现之前,由细菌感染造成的死亡很常见一样[4]。抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene, args)自身具备较强的适应性和稳定性,且一旦被可移动元件转移,它将会长期稳定地存在于受体菌的基因中,因此与常规的痕量有机污染物相比,抗性基因对生态环境和人类健康更具有危害潜力。最近联合国认识到需要在政治层面解决抗生素耐药性有关的迫在眉睫的多方面问题,方法是实施包括对人类健康和可持续粮食生产的长期威胁在内的国家行动计划[5]

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2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

以多重耐药菌pseudomonas.putida mx-2为目标菌,探究fe0/na2s2o8消除水体中多重耐药菌及抗性基因效果及其机制。

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3. 研究的方法与方案

1.研究方法

(1)查阅相关文献,深入了解与掌握相关知识;

(2)设计实验,准备实验仪器与材料;

(3)认真仔细做实验,及时记录数据并分析。

2.技术路线

3.实验方案

一.污泥中多重耐药菌的分离筛选

(1)激活污泥

污泥来自江苏无锡太湖污水处理厂二沉池,取100 g污泥4000 g离心5 min,弃上清,而沉淀物用8 mL胰蛋白酶大豆汤(TSB)重悬并放置在28℃摇床180 rpm振荡过夜,然后将培养物静置10 min,待其有明显分层后,取5 mL上清液4000 g离心5 min,弃上清,贴壁的沉淀物用0.1TSB洗涤三次,然后用1.0 mLTSB重悬沉淀物至均匀悬液,待涂分离筛选耐药菌株用。

(2)分离筛选耐药菌株

选取的抗生素有:庆大霉素(氨基糖苷类)、四环素(四环素类)、红霉素(大环内酯类)、磺胺甲恶唑(磺胺类)、万古霉素(糖肽类),首先配制上述五种抗生素母液,称取一定量LB琼脂配制培养基,121℃灭菌20min,待培养基温度降至约50℃时,向其中依次加入一定体积的庆大霉素、四环素、红霉素、磺胺甲恶唑、万古霉素母液,其工作浓度见下表。摇匀,然后迅速倒入一次性无菌平板中,在无菌通风处中吹干待用。

吸取100 μL1.1中准备好的菌悬液至1.2准备的包含五种抗生素的平板上,采用平板涂布法分离筛选菌株,放置在37℃无菌恒温培养箱培养24 h,待长疑似纯的菌落后,用接种环挑取上述单菌落在包含抗生素的平板上划线,37℃无菌培养24 h,可反复划线最终获得单菌落,将分离纯化的单菌落划线在斜面上,37℃无菌培养24 h,最后放置在4℃冰箱保存,用于后续的表型试验和全基因测序,同时以菌液:甘油=8:2的形式甘油长时间保存菌体,-20℃冷冻储存。

抗生素种类

溶解度(mg/L)

工作浓度(mg/L)

庆大霉素Gentamicin

50

50

四环素Tetracycline

50

10

红霉素Eryphilin

2(溶剂乙醇)

50

磺胺甲恶唑Sulfamethoxazole

-(溶剂乙醇)

100

万古霉素Vancomycin

易溶于水

2

放线菌酮Cycloheximide

20

100

二.药物敏感试验(K-B法)

用接种环挑取斜面上的单菌落至5 mL TSB培养基中,28℃条件下180 rpm培养一定时间,待菌密度达1.0~2.0×108 Cells/mL(OD600=0.1)时,吸取100 μL菌液采用平板涂布法将其均匀涂布至LB琼脂培养基上,用镊子夹取药敏片贴到LB琼脂培养基上,每个平板均匀放置5个药敏片且保证药敏片之间的距离≥24 mm,用镊子轻轻按压至贴合良好,然后将平板倒置在37℃无菌恒温培养箱中,每隔6 h观察抑菌圈生长情况,待抑菌圈的边缘长得清晰后,用标准卡尺测量抑菌圈直径D大小并做好记录,整个操作在无菌条件下完成。药敏片种类包括:氨基糖苷类:庆大霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、萘替米星;四环素类:四环素、强力霉素;磺胺类:复方新诺明又名磺胺甲恶唑、磺胺异恶唑;糖肽类:万古霉素、替考拉林;MLSB类:红霉素、阿奇霉素、林可霉素;β-内酰胺类:阿莫西林、头孢他啶、氨苄西林;FCA类:氯霉素、环丙沙星、氧氟沙星。

三.探究反应条件对Fe0/Na2S2O8杀灭水体中多重耐药菌的影响

(1)优化纳米Fe0/Na2S2O8反应条件(Fe0投加量、Na2S2O8浓度)

向100 mL的无菌水中加入一定浓度的P. putida MX-2,保证反应液中菌密度为~106 cells/ml,向体系中加入一定量的Fe0和Na2S2O8触发反应。为探究Na2S2O8浓度对杀菌效果的影响,设定Na2S2O8浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mM。为探究Fe0投加量对杀菌效果的影响,设定Fe0投加量依次为0.05、0.075、0.1、0.2、0.5 g/L,同时设置仅含有Na2S2O8和仅含有Fe0的对照,用2 M H2SO4或2 M NaOH调节反应液pH至6.0,28℃,180 rpm振荡反应,在0、10、20、30、40、50、60、90min取样1 mL,梯度稀释,吸取100 μL涂平板。37℃无菌倒置平板培养36 h,统计菌数量。

(2)探究不同初始pH条件下的Fe0/Na2S2O8体系对ARB去除效果

向100 mL的无菌水中加入一定浓度的P.putidaMX-2,保证反应液中菌密度为~106cells/ml,用2 M H2SO4或2 M NaOH调节反应液pH分别至2.5、4.0、5.5、7.0、8.5、10后,按照3.1确定的最优Fe0和Na2S2O8的使用量,迅速投加至体系中从而触发反应。28℃,180 rpm振荡反应,在0、10、20、30、40、50、60、90min取样1 mL,梯度稀释,吸取100 μL涂平板。37℃无菌倒置平板培养36 h,统计菌数量。同时设置对照,即只调控菌液(菌密度为~106cells/ml)的初始pH至2.5、4.0、5.5、7.0、8.5、10,但不引入Fe0和Na2S2O8,以此来说明不同初始pH对Fe0/Na2S2O8体系去除P.putidaMX-2的过程中,化学酸化和活性物种在其中的贡献情况。

四.探究不同初始pH条件下的Fe0/Na2S2O8体系消减ARGs能力及其机理

向200 mL的无菌水中加入一定浓度的P. putidaMX-2,保证反应液中菌密度为~106cells/ml,调整反应液初始pH依次为2.5、4.0、5.5、7.0、8.5、10,按照之前确定的最优Fe0和Na2S2O8使用量加入到体系中,28℃ 180 rpm反应120 min。要监测的指标有:

a.通过q-PCR手段定量aac6-lbtetA-01、tetA-02、sull、strA-01、mexFacrB七个抗性基因总量。

b.通过淬灭实验和ESR确定不同pH下的活性物种。

c.用SYBR Green I和PI染料双结合的方式测定核酸破坏和细胞膜破坏情况。

已知质粒携带的ARGs是aac6-lb、tetA-01、strA-01,,染色体都携带的ARGs有tetA-02、mexF、acrB、sul1。通过选择对不同位置和种类的ARGs进行q-PCR和分析数据,去确定不同空间位置和碱基组成的ARGs对Fe0/Na2S2O8处理作出反应的差异。

总DNA提取方案:取样70 mL,向其中迅速加入154 mL乙醇和7 mL 2 M乙酸钠溶液,-20℃放置过夜后,利用离心的方法(10000 g, 10 min)获得沉积物,用少于30 mLPBS冲洗沉积物,并转移至50 mL塑料离心管-20℃条件下储存过夜,然后进行冷冻干燥2-3

天,利用MoBio PowerSoil试剂盒直接提取上述方法所收集细胞中的DNA,-20℃保存。

胞内/外DNA提取方案:取70 mL反应液过0.22 μm滤膜,收集滤膜至2 mLEP管中,利用MoBio PowerSoil试剂盒直接提取滤膜上的DNA,此为e-DNA,具体步骤见说明书。同时,取70 mL滤液,向其中迅速加入154 mL乙醇和7 mL 2 M乙酸钠溶液,-20℃放置过夜后,利用离心的方法(10000 g, 10 min)获得沉积物,用少于30 mLPBS冲洗沉积物,并转移至50 mL塑料离心管-20℃条件下储存过夜,然后进行冷冻干燥2-3 d,利用MoBio PowerSoil试剂盒直接提取上述方法所收集细胞中的DNA,此为i-DNA。

q-PCR反应体系包括:SYBR Green染色体5 μL、上下游引物各1 μL、dH2O 1μL和DNA模板2 μL,同时设阴性对照,采用Roche LightCyler 480 II对ARGs进行定量测定,其反应条件是PCR反应条件:

1cycle

95℃ 5min

40cycles

95℃ 10s

60℃ 15s

72℃ 15s

1cycle

95℃ 5s

65℃ 1min

--cycles

0.11℃ 5s (融解曲线)

4.实验可行性分析

Fe0/Na2S2O8作为一种新型且成熟的高级氧化技术已被广泛用于多种难降解有机污染物的去除,且根据前人研究发现,高级氧化技术如芬顿法具有消除抗生素抗性的能力,因此,选用Fe0/Na2S2O8法消除抗生素抗性具有很大的研究可行性。

4. 研究创新点

目前,城市污水中ARGs去除方面的研究并不多,而且将Fe0/Na2S2O8工艺运用到消除城市污水中ARGs的研究更是鲜有报道。因此,以多重耐药菌P.putidaMX-2为目标,探究Fe0/Na2S2O8降解P.putidaMX-2的抗性基因的效果及机制,具有很强的创新性。

5. 研究计划与进展

2月:查阅相关文献,收集资料,完成开题报告;

3月:优化fe0/na2s2o8杀灭p.putidamx-2的最优反应条件;3月:探究不同初始ph对fe0/na2s2o8体系杀灭p.putidamx-2的影响;

4月-5月:探究fe0/na2s2o8法消减args的效果及其机制;

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