1. 研究目的与意义
研究背景
反硝化型甲烷厌氧氧化( denitrifying anaerobic methaneoxidation，damo) 即甲烷厌氧氧化耦合反硝化，是指在厌氧条件下以甲烷作为电子供体，no2-/no3-作为电子受体的反硝化过程。甲烷是一种温室气体，其引起的温室效应是等物质量 co2 的 20-30 倍。damo 过程利用甲烷代替常规碳源进行脱氮，有利于减少温室效应，并改善氮循环。研究发现，candidatusmethylomirabilis oxyfera 细菌candidatusmethanoperedens nitroreducens 古菌是参与 damo 过程的 2 类主要功能微生物，前者通过内部好氧机制耦合亚硝酸盐还原与甲烷的厌氧氧化，后者则通过逆向产甲烷途径耦合硝酸盐还原与甲烷的厌氧氧化。damo细菌-candidatus methylomirabilis oxyfera的环境分布及活性影响因素已经得到了一定的研究，而damo古菌-candidatus methanoperedens nitroreducens的环境功能及环境影响机制却一直被大家所忽视。
研究目的及意义：
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
本课题拟以damo微生物（damo古菌 damo细菌）为主要研究对象，以太湖（氮含量超标，适合damo过程的发生）为代表性研究区域（以太湖苏州段为主要取样区域）：
1. 调研damo微生物在太湖底泥沉积物中的分布特征，推测damo微生物的分布规律。
3. 研究的方法与步骤
1. 样品采集
在太湖苏州段-胥湖区域选取三个取样点，通过底泥柱状采样器进行底泥样品采集。同时采集上层水样。将采集的底泥样品和水样尽快送回实验室，低温保存，用于后续实验分析测定。2. 水样含氮量测定对上层水样进行过膜处理，对底泥含水样品进行离心及过膜处理。将过膜所得的水样置于冰箱冷藏保存，直至进行氮化合物含量测定。本实验项目通过紫外分光光度法测定样品中的氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐含量。3. 底泥dna提取称取0.3g底泥样品进行基因组dna提取。提取的dna通过超微量核酸蛋白测定仪进行浓度和纯度测定。4. pcr扩增对样品dna进行pcr扩增（damo古菌damo细菌16s rrna基因），检测damo微生物在其中的存在情况。damo古菌通过特异性引物dp142fdp779r进行扩增，damo细菌则通过巢式pcr进行扩增：第一轮pcr使用202f1545r引物，第二轮扩增则使用n-damo特异性引物组qp1fqp1r。5. 定量pcr对样品dna进行定量pcr检测，分析damo微生物在不同样品中的含量差异。使用damo细菌特异性引物组qp1fqp1r以及damo古菌特异性引物对dp397fdp569r进行定量pcr分析。定量pcr采用一系列具有已知拷贝数的10倍稀释的质粒dna构建标准曲线。6. 高通量测序通过高通量测序获得样品中的微生物菌群信息。利用引物对nobar 341f/nobar 805r扩增细菌16s rrna基因的v3-v4区，利用引物对340f/1000r和349f/806r通过巢式pcr扩增古菌16s rrna基因的v3-v4区。对测序所得的低质量序列和部分人工复制序列进行质量控制(qc)评价，并对所有通过qc的序列进行聚类分析。序列以97%的相似性聚类成操作分类单元(otus)。7. 统计分析使用canoco软件、利用相关性分析方法（cca/rda）分析环境因子、样品和菌群之间的相关性。
4. 参考文献
[1] ashna a. raghoebarsing, arjan pol, et al. a microbial consortium couples anaerobic methane oxidation to denitrification [j]. nature, 2006, 440(7086): 918-921.
[2] jing ding, liang fu, et al. environmental evaluation of coexistence of denitrifying anaerobic methane-oxidizing archaea and bacteria in a paddy field [j]. applied microbiology and biotechnology, 2016, 100: 439-446.
[3] jiaqi wang, lidong shen, et al. spatial and temporal distribution of nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing bacteria in an intertidal zone of the east china sea [j]. applied microbiology and biotechnology, 2017, 101(21): 8007-8014.
5. 计划与进度安排
(1) 2022年2月1日~2022年3月11日 接受毕业设计任务书，查阅资料，翻译外文翻译。
(2) 2022年3月12日~2022年3月22日 编写开题报告。
(3) 2022年3月23日~2022年5月17日 开展相关实验，编写毕业论文初稿。
