1. 研究目的与意义
| 1.1 课题研究目的及意义 土壤是人类赖以生存和发展的重要资源之一，是农作物生长所需营养的主要来源，也是人类生态环境的重要组成部分，在生态系统中占有重要的地位[1]。近年来，随着工业、农业、交通运输业的快速发展，大量有害重金属排放到环境中，引起生态环境恶化，重金属污染具有隐蔽性、累积性、不可逆性和难降解，一旦重金属进入到土壤系统，不仅导致土壤的退化、农作物产量下降，而且还可能通过食物链及其他途径直接或间接的危机人类的健康和生命[2]。因此，治理土壤重金属污染刻不容缓。 铬是生物毒性极强的重金属元素，目前，随着铬矿的加大开采与冶炼以及电镀印染等工业快速发展，重金属铬被广泛用于工业生产各个过程中，上述生产环节中未经处理或处理力度不够的含铬废液废渣排入环境中将会危害环境。其中溶性六价铬具有较强的致癌和致突变特性，并且其迁移转化能力强，易游离出最初污染部位；而三价铬相对惰性强，不易迁移，另外，六价铬化合物的毒性约为三价铬的 100 倍，致突变率约为三价铬的1000 倍[3]。在所有重金属污染场地中，铬污染场地数量占较大的比重，主要包括20多处铬盐厂关停后的遗留场地、40多处历史遗留铬渣堆放场地、上千家电镀(镀铬)企业场地及数百家鞣革企业场地等[4]。目前，国内仅有规模较小的场地展开土壤污染治理工作，而典型场地的污染状况不容忽视。 治理重金属污染刻不容缓,各种修复技术和措施正在研究和应用中。目前国内外处理重金属铬污染的方法有物理修复（客土、换土、深耕翻土等）、化学修复（离子交换法、化学沉淀法、活性炭吸附法、反渗透萃取法等）[5]。这些方法虽然已经广泛应用于电镀和铁合金生产等行业，但其本身存在占地面积大、污泥多、处理成本高，还可能造成二次污染等问题。生物法治理铬污染主要是微生物通过还原、吸附、吸收和超积累将铬的去除[6]，在生物除络法中，具有高效除铬功能的铬还原菌利用碳源和电子供体对 Cr(Ⅵ)进行还原生成低毒的 Cr(Ⅲ)受到越来越多的重视[7]，其成本低、无二次污染等优点，从而使得其成为处理Cr 污染的研究热点。 微生物修复中菌种是关系到修复效果的重要因素,本土菌株具有性能稳定、易于培养、适应环境快等优势,所以筛选及驯化合适的本土菌株是微生物修复中基本而重要的工作[8]。
1.2 课题研究目的及意义 随着现代化工业和农业的发展以及矿产资源的开发利用，重金属污染越来越严重，土壤重金属铬污染已成为一个全球性的环境质量问题。在电镀、化工、颜料、制革、轻工纺织、制药、铬盐生产和采矿冶炼等行业生产中得到广泛的应用，与此同时，铬及其化合物的污染问题也越来越严重。土壤中的重金属铬会影响植物的生长，降低作物的产量和品量，并造成严重的经济损失，另外，铬的毒性强且不能被生物体分解，在空气、水、食品和土壤中的络，通过食物链在生物体内富集，可直接或间接地进入人体，导致严重的后果因此治理重金属污染刻不容缓。 基于微生物对重金属具有积累和解毒的作用，并且运用微生物处理重金属污染具有效率高、费用少、对环境影响小等优点，近年来，微生物修复技术越来越受到关注。微生物除可用来修复被重金属污染的土壤外，还可以用来处理有机污染物和废水。因此，研究微生物对重金属污染修复、筛选鉴定驯化出本土菌种不仅具有重要的理论意义和广阔的应用前景，而且还将带来一定的经济价值和社会效益。
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2. 研究内容和预期目标
| 本课题主要研究内容： （1）除铬微生物的单一菌种的筛选、驯化、和扩大培养。 一般是从污染场地釆样，经分离纯化，在含络培养基中筛选出耐铬菌株；将筛选出的耐铬菌株进行紫外诱变，获得高效铬还原菌株。显微镜观察高效铬还原菌株的形态，初步鉴定其种类，并研究该菌的生长曲线。 （2）高效降解菌株的形态学、生理生化及分子生物学鉴定。 （3）高效菌株处理铬的条件优化。 分别考察了高效菌株处理含铬土壤的最佳条件，包括时间、温度、接种量、搅拌速率和最初浓度，获得微生物处理的最佳的条件。
本课题预期目标: 筛选、驯化、和扩大培养除铬微生物的单一菌种，再考察得到此菌株对六价铬有还原性，并且去除效率高。
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3. 研究的方法与步骤
| 3.1 课题拟采用的研究方法 一般菌样来源于污染场地，先用采用随机布点法在污染场地周围选择5 个点，采集表层土壤（0～20cm），均匀混合后用四分法取舍组成一个混合样，约 200g选取较为潮湿的土壤。用铲子采集适量土壤，剔除碎石、砂砾及植物残体，装入塑料袋中，带回实验室 ℃保存。然后测定土壤中重金属含量确定耐重金属菌株存在的可能性，若确定有重金属铬存在，之后土壤样品用划线分离和平板涂布分离得到菌株并进行鉴定，以含铬培养基进行菌株驯化，不断的分离纯化，最终得到所需菌株。 所用培养基为两个，基本培养基和驯化培养基，所用仪器全温震荡培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、电热恒温培养箱、手提式压力蒸汽灭菌器、紫外辐照箱、紫外分光光度计光学显微镜等。
3.2 课题拟采用的步骤 （1）采土样 先用采用随机布点法在污染场地周围选择5 个点，采集表层土壤（0～20cm），均匀混合后用四分法取舍组成一个混合样，约 200g选取较为潮湿的土壤。用铲子采集适量土壤，剔除碎石、砂砾及植物残体，装入塑料袋中，带回实验室 4℃保存。 （2）Cr(Ⅵ)耐受菌的筛选、分离和纯化 称取 10g 土壤样品于灭菌的 200m L 锥形瓶中，加入 100m LCr(VI)浓度为500mg/L 的液体培养基，置于恒温摇床中，30℃，150r/min 摇床培养 24h。取出后用 10 倍稀释法将其稀释后涂布在固体培养基上。具体操作：用移液枪先吸取 1m L泥浆于装有 9m L 无菌水的试管中，充分混匀，此为 10-1；从 10-1试管中吸取 1m L于另一只装有 9m L 无菌水的试管中，充分混匀，此为 10-2，以此稀释到 10-8。从各试管中分别吸取 200μL 液体，用玻璃棒涂布在凝固的固体培养基上。将平板倒置置于 30℃恒温培养箱中培养 2～5d，观察菌落形态。挑取不同形态和颜色的单菌落，采取分区划线法，平板划线将其分离培养 2～3d，使菌种进纯化。在分离细菌的平板上挑取单菌落，再次平板划线，使菌种进一步纯化。将其置于 4℃冰箱中保存备用。以上实验材料均在 121℃下高压灭菌，并且整个操作过程在无菌操作台上进行。 （3）Cr(Ⅵ)还原菌的筛选 之后将用平板划线法分离纯化得到的纯种菌株，转接入灭菌的液体培养基，活化24h。分别取 25m L 活化菌液加入有 50m L 含 Cr(VI)培养基的 100m L 锥形瓶中。置于恒温摇床中，30℃、150r/min 摇床培养 24h。选取颜色发生变化的菌种。 再对此菌种进行还原能力检测，将得到的具有 Cr(VI)还原能力的纯种菌株，用普通液体培养基活化 24h。取25m L 菌液分别加入装有 50m L 含 Cr(VI)培养基的锥形瓶中。瓶中 Cr(VI)浓度分别为 50、100、150 和 200mg/L。置于恒温摇床中，30℃、150r/min 摇床培养，每隔24h 测定其液体中残余的 Cr(VI)含量。 其中六价铬测定方法： Cr(VI)标准曲线绘制 向 10 支规格一致的 25m L 比色管中分别加入 0、0.25、0.50、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 和 25m L 铬标准溶液，用水稀释至标线，加入（1 1）硫酸溶液 0.5m L和（1 1）磷酸溶液 0.5m L，加入 1m L 显色剂后摇匀，静置 8～12min，移入 3cm比色皿于 540nm 波长测定吸光度并作空白校正，以蒸馏水作参比。将测得的吸光度绘制吸光度对 Cr(VI)含量的标准曲线。 菌液中 Cr(VI)的测定 根据国家环境监测标准规定，溶液中 Cr(VI)的浓度采用二苯碳酰二肼分光光度法测定：取 5m L 加有 Cr(VI)的菌液以 8000r/min 离心 5min，以上清液进行测定实验。取适量上清液，置于 25m L 比色管中，用水稀释至标线，加入（1 1）硫酸溶液 0.5m L 和（1 1）磷酸溶液 0.5m L，摇匀后加入 1m L 显色剂，静置 8min 后，移入 3cm 比色皿于 540nm 波长测定吸光度并作空白校正，以试剂空白作参比。从标准曲线上查得 Cr(VI)含量。 试剂配置 显色剂（二苯碳酰二肼）：称取 0.20g 二苯碳酰二肼，溶于 50m L 丙酮中，加水稀释至 100m L，超声波使其充分溶解。储存于棕色试剂瓶内，于 4℃保存一个月左右，色深后不能再使用。 Cr 标准储备液：称取 1.414g 重铬酸钾，溶于蒸馏水中，定容至 10m L。重铬酸钾预先于 120℃干燥 2h，去除其所含水分。 Cr 标准溶液：吸取 2 m L 储备液至容量瓶，定容至 1L。使用前配制。 （1 1）磷酸溶液：将磷酸加入等体积水中。 （1 1）硫酸溶液：将硫酸加入等体积水中，操作时注意顺序是硫酸沿玻璃棒缓慢加入水中，防止反应时温度过高。 （4）菌株驯化 将所得高效还原菌株分别接种于驯化培养液的的锥形瓶内，震荡培养而后转接于驯化培养液中培养，定吋检测浓度，蹄选出优良的强降解菌株。 （5）Cr(Ⅵ)还原菌菌种鉴定 a形态学鉴定 菌落培养及形态观察： 滴一小滴水在载玻片上，挑取幼龄菌种在水中，将载玻片在酒精灯火焰上过次，盖上盖玻片，于光学显微镜下观察，油镜下拍照。考察该鉴定菌株的菌落形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度等。 革兰氏染色： 将已充分活化的蹄选驯化出的待鉴定菌株接种到基础液体培养基中30°C培养18h。进行革兰氏染色（需用一革兰氏阳性菌或阴性菌混合涂片作对照），然后在光学显微镜不同倍数下观察该菌株细胞的形态、菌体大小及颜色。 鞭毛芽孢染色: 将该鉴定菌株在固体斜面培养基上连续接种2-3次，每次培养18-24h，用接种针沾取单菌落点于半固体培养基上，30°C培养12-18h，取菌落边缘的菌体进行鞭毛染色，显微镜镜检。 b生理生化鉴定 生理特征的鉴定: 培养基：硫酸镁0.2g，硫酸铵2g，氯化钙0.1g，磷酸氢钾0.5g，硫酸氢钠0.5g， 蒸循水1L。糖醇类为0.5~1.0%，其余碳源为0.1~0.2%，以菌悬液接种于培养基中，连 续接种3代均可生长者判定为阳性。 生化特征的鉴定： 过氧化氯酶法，取适量的培养的斜面菌种涂抹于滴有适量的载玻片上，有气泡产生者 判定为阳性。 c菌株的分子生物学鉴定 菌落 PCR 模板的制备：挑取少量单菌落至装有 30μL 灭菌的去离子水的 PCR管中，置于 PCR 仪中 98℃加热 5min，于 75℃降温 15min,再转移至 1.5ml 离心管中，8500r/min 离心 10min，上清液中即含有菌种 DNA。 PCR 反应温度设置：95℃预变性 5min；4℃变性 1min，56℃退火 1min，72℃延伸 1 min 30s，30 个循环；最后 72℃延伸 10min 结束反应。 PCR 反应结束后，产物通过 1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳结束后，在凝胶成像系统中观察电泳结果并拍照保存使用普通电泳进行检验，此时的 DNA大小应为 1.5Kbp 左右。 PCR 产物检测回收后送往相关部门测序。测序结果在NCBI 数据库中应用 BLAST 程序与数据库中已有的细菌 16Sr DNA 序列进行同源性比较分析。
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4. 参考文献
| [1]李芳钱秋芳土壤重金属污染研究进展[J]安徽农学通报,2011,17(10):80-82. [2]Pandey N, Sharma C P. Effect of metal Co2 Ni2 and Cd2 on growth and metabolism of cabbage[J]. Plant Science, 2002, 163(4): 753-758. [3]徐天生. 对重金属铬污染环境具修复作用的真菌初步研究[D]. 上海海洋大学, 2015. [4]尹贞, 张钧超, 廖书林,等. 铬污染场地修复技术研究及应用[J]. 环境工程, 2015, 33(1):159-162. [5] 孙光闻.重金属污染及治理研究进展[J]南方农业,2007,1(2):41-43. [6] Cheung KH, Gu JD. Mechanism of hexavalent chromium detoxification by microorganisms and bioremediation application potential: A review[J]. International Biodeterioration Biodegradation. 2007, 59(1): 8-15. [7] Patra RC, Malik S, Beer M et al. Molecular characterization of chromium (VI) reducing potential in Gram positive bacteria isolated from contaminated sites[J]. Soil Biology Biochemistry. 2010, 42(10): 1857-1863. [8] Francisco Javier Acevedo-Aguilar, Angeles Edith Espino-Saldaa, et al. Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes, using chromate-resistant strains of filamentous fungi indigenous to contaminated wastes [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2006, (52): 809-815. [9] 张剑. 高效降Cr(Ⅵ)菌的筛选、鉴定及其降解特性[D]. 湘潭大学, 2011. [10] Ahmad B．Albadarin Influence of solution chemistry on Cr(VI) reduction and complexation onto date-pits/tea-waste biomaterials [J] ．Journal of Environmental Management，2013，(114)：190-201. [11] 《铁合金工业污染物排放标准》GB 28666-2012). [12] 刘磊, 肖艳波. 土壤重金属污染治理与修复方法研究进展[J].长春工程学院学报:自然科学版. 2009, 10(3): 73-78. [13] 贺迪. 重金属污染土壤的植物修复及钙离子的调节作用研究[D]. 湖南大学. 2007 [14] Urvashi T, Datta M. Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005, 21(6-7): 891-899. [15] 刘华良, 王晓蓉, 周徐海 et al. 铬污染土壤/沉积物的修复技术研究进展[J]. 环境污染与防治. 2005, 5(2): 1-5. [16] 龙新宪, 杨肖娥, 倪吾钟. 重金属污染土壤修复技术研究的现状与展望[J]. 应用生态学报. 2002, 13(6): 757-762. [17] Hanane Saye1．Cr(VI)reduction by Enteroeoecus gallinarum isolated from tannery waste contaminated soil[J]．Ann Microbial，2012，(62)：1269-1277. [18] 马锦,瞿建国,夏君，李福德. 火活微生物和活体微生物处理含铬废水研究进展环境 科宁与技术，2006,29(4):103-105.
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5. 计划与进度安排
| （1）2022年2月1日~2022年3月1日接受毕业设计任务书，查阅资料，撰写开题报告，完成外文翻译，形成初步的实验方案。 （2）2022年3月2日~2022年5月1日开展相关试验，编写毕业论文初稿 （3）2022年5月6日~2022年5月31日毕业论文定稿 （4）2022年6月1日~2022年6月10日准备答辩
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