重组蓝细菌光敏色素AM1_6305g3的荧光特征开题报告

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1. 研究目的与意义

荧光光谱法由于其灵敏度高、选择性好,获得的信息直观、准确,能科学表达解释复杂样品的结构、分布、含量及生理功能等诸多问题,所以在生物分析及造影方面应用广泛。荧光染料或荧光试剂作为分子探针在生命科学领域备受瞩目。

该实验目的是提高现有荧光试剂的荧光量子产率与近红外染料的长波长发射即低背景干扰相结合，同时要求新合成的荧光染料激发波长与激光光源相匹配，以获得最大的荧光强度。

2. 国内外研究现状分析

由1962年，Shimomura首次从Aequorea victoria中发现了绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）。到1992年Prasher对GFP进行了克隆，得到了它的cDNA序列，并发现该序列编码由238个氨基酸残基组成的蛋白质，再到1994年将GFP的基因在E. coli和秀丽线虫中外源表达。使科学家们对这种能够通过自催化过程发出荧光的蛋白得到重新认识，并利用其可遗传性作为生物标记物来使用，自此开辟了一个新的技术研究领域。avGFP最早的突变体展现出蓝色，青色和黄绿色的发射光谱，但是直到2008年，都没能拥有最大发射超过529 nm的个体。然而，早在1999年，科学家们就从其他的动物体内发现了能很大程度上扩大颜色范围的红色荧光蛋白，并直到现在仍为生物领域广泛的运用。

当然，随着生物研究的不断发展，红色荧光蛋白不仅仅作为荧光标记颜色的一种多样化选择，同时科学家们仍不断的赋予和探求其新的特性。如发射光谱的红移，光诱导荧光蛋白和长斯托克斯位移蛋白等。目前，通过对活细胞、组织和活体进行成像的方式进行实时、动态的研究，被认为是最直观、最简便、最有效率的一种新模式。那么，荧光蛋白所具有的无侵袭性标记和追踪活体中特定细胞类型的特点，使其成为该类研究的首选。随着整体成像系统的发展，荧光蛋白能够达到目的基因启动子活性的可视化，追踪胚胎发育及炎症反应过程中细胞的运动，监测小型寄生虫在宿主内的迁移及对癌症－些重要方面的研究，如肿瘤细胞的运送、侵袭、代谢及血管生成等。在动物组织中存在的黑色素、血红蛋白巧脂肪，是可见光区域中主要的光子吸收物质。水能吸收大于1100nm的波长。加之，波长的增加能够降低光散射的强度。出于上述原因，活体中可视化的最佳＂光学窗口＂近似于650-1100nm之跡气也就是说，越是具有红移的激发和发射光谱的荧光蛋白，越是能减少其自发巧光，降低光散射，同时再长波长的情况下，荧光蛋白的光毒性也较低。当然，这也说明了，只有拥有这些特性的红色荧光蛋白才是活体成像的优选探针，特别是在深层组织成像中能达到低背景噪音的效果。那么，对红色荧光蛋白的改造就自然而然落到了对其激发和发射光谱红移的目标之上，同时提高组色荧光蛋白在长波长光谱区域的亮度。目前，对于水生生物来源的红色荧光蛋白，具有最长发射波长的仅为由Kiiyl D. Piatakevidi等人所改造出的TagRFP675突变体。而早在2009年，由Xiao kun等人发现一类细菌光敏色素蛋白，普遍都具有较长的波长（644nm激发，672nm发射），经过对其发色团结合域的改造，得到最大激发和发射为684和708nm的近红外荧光蛋白（IFPs）。最近，Shcherbakova等人将这种细菌光敏色素蛋白的光谱又向更加红移的方向进行了改造，得到了最大激发为702nm，最大发射为720nm的新突变体，并将其命名为IFP720。

3. 研究的基本内容与计划

研究内容：利用分子生物学，生物化学和蛋白质工程有关技术，构建含有色素合成酶编码基因和含辅基蛋白编码基因的融合基因片段，并且把它插入到大肠杆菌表达载体。

研究计划：1、2017.12-2018.1 ：阅读与研究课题相关的文献。

2、2018.1.5-2018.1.20：完成与课题相关的实验，得出实验所需数据；主要是分子克隆gaf编码基因到植物表达载体，为进一步的研究奠定基础。

4. 研究创新点

基于蓝细菌光敏色素的荧光蛋白具有潜在的应用价值，可以作为生物学荧光探针。本研究试图构建带有编码荧光色素蛋白PCB-GAF3的细菌表达载体，使得这种蛋白能在大肠杆菌中表达，为进一步的研究奠定基础。