不同生境青枯菌对有益菌抵抗力的差异及其机制研究开题报告

全文总字数：5775字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题的意义：

1880年，美国北卡罗来纳州首次发现了烟草青枯病^[1]。此后，由茄科雷尔氏菌 (青枯菌，ralstonia solanacearum)引发的植物细菌型青枯病（bacterial wilt）已成为一种遍及全球的灾难性土传病害。全球范围内，其在亚热带、热带等气候温暖的地区有广泛的分布^[2]，在我国，也严重影响了南方的多个省市地区^[3]。青枯菌菌系复杂，宿主范围广泛，据不完全估计，可侵染超过50个科数百种植物^[4]，严重影响了我国番茄^[5]、马铃薯^[6]、玉米^[7]、辣椒^[8]、生姜^[9]、烟草^[10]等农作物和经济作物的栽植。因此，防控青枯病是一项刻不容缓的任务。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：

1.鉴定各个青枯菌对解淀粉芽孢杆菌的抵抗力，分析其与生境的相关性。

2.鉴定各个青枯菌的表型，与抵抗力相耦合，判断是否存在权衡。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

实验室实验检测不同青枯菌的表型性质及对解淀粉芽孢杆菌的抵抗力，通过相关性分析判断两两之间的关系。

技术路线：

1.对解淀粉芽孢杆菌的抵抗力测定

2.青枯菌的表型性质测定

3.耦合分析

实验方案：

1.抗阻性的研究：

青枯菌的筛选：

首先将每种预培养的RS溶液（在液体NA培养基中）以4500 rpm离心5分钟。舍去上清液后，小心地加入生理盐水调节浓度以确保OD₆₀₀= 0.5。

T-5发酵液的制备：

将T-5培养到含有50ml NA培养基的150ml烧瓶中，并在170rpm、30℃下振荡24小时。然后将T-5溶液在10000r/min下离心10分钟并通过0.22μm过滤器过滤以获得T-5发酵液。

NA培养基的制备（1L体系）：

实验方法：

将2μL RS溶液 2μLT-5发酵液 196μL 10％NA培养基于96孔微孔板中，170rpm，30℃摇匀，每12h测试OD₆₀₀。

2. 泳动能力的研究

青枯菌的筛选：

首先将每种预培养的RS溶液（在液体NA培养基中）以4500rpm离心5分钟。舍去上清液后，小心地加入生理盐水以确保OD₆₀₀= 1.0。

NA培养基的制备（1L体系）：

泳动性培养基的制备：

10％NA培养基 0.2％琼脂

实验方法：

用移液管将5ml熔融培养液注入直径6cm的平板中。将10μL的RS溶液加入到平板的中间。在室温下培养24小时后，泳动晕圈的直径估计为RS的泳动能力。

3.产生物膜能力的研究：

青枯菌的筛选：

首先将每种预培养的RS溶液（在液体NA培养基中）以4500rpm离心5分钟。舍去上清液后，小心地加入生理盐水以确保OD₆₀₀= 1.0。

MSGG培养基的制备：

2％无机盐 10％MOPS 88％磷酸钾缓冲液

无机盐成分：

MOPS:

将20.93g MOPS溶解于100mL H₂O中,用NaOH调节pH = 7.0。

磷酸钾缓冲液:

用KOH调节pH = 7.0。

洗涤缓冲液：

80％无水乙醇 20％丙酮

实验方法：

将2μL RS溶液加入到96微孔板中的198μL MSGG培养基中。将微孔板在30℃下静置培养24小时。然后，吸收整个溶液，同时加入100μL 1％结晶紫着色20分钟。然后吸收结晶紫，剩余的生物膜用200μL去离子水仔细洗涤10次。每孔加入100μL洗涤缓冲液。以50rpm摇动板15分钟。将20μL溶液转移到填充有180μL ddH₂O的新96孔微孔板中。OD₅₇₀即估计为生物膜形成能力。

4.产铁载体能力的研究：

青枯菌的筛选：

首先将每种预培养的RS溶液（在液体NA培养基中）以4500rpm离心5分钟。舍去上清液后，小心地加入生理盐水以确保OD₆₀₀= 0.5。

注意避免含铁污染物

实验方法：

将2μLRS溶液转移到198μLMKB培养基中，在170rpm，30℃下振荡48小时。离心和过滤后，将100μL上清液与100μLCAS溶液混合。在将平板静置2小时后，测试得OD₆₃₀作为铁载体生产能力。

可行性分析：

本实验采用的实验方法均为标准、通常的实验方法，本实验可行。

4. 研究创新点

特色或创新之处：

本实验选用了320余株野外分离及条件进化获得的青枯菌：

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

3月5日至3月15日：完成测定青枯菌抗阻性的实验

3月16日至3月25日：完成测定青枯菌泳动能力的实验