基于结构基础的F/10家族木聚糖酶耐热突变体的理性设计开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

半纤维素是组成植物细胞壁的重要组成成分，同时也是自然界中最丰富的生物质资源之一，含量仅次于纤维素。

木聚糖(xylan)和木葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖、 阿拉伯半乳聚糖共同构建了半纤维素，其中木聚糖在半纤维素中所占比例最高。

此外，木聚糖成分还是植物细胞壁中连接纤维素和木质素的桥梁，是细胞壁稳定的基础，因此对木聚糖成分降解的研究对生物质资源的利用格外重要。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：以已知结构的f/10家族耐热木聚糖酶为基础，分析获得蛋白热敏感关键位点，对相应位点进行点饱和突变，通过对突变体文库进行筛选，最终获得热稳定性提高的突变体。

主要内容：首先要根据蛋白质的结构、功能和机制等详细资料对氨基酸序列中要突变的位点进行理性设计 然后通过点饱和突变手段改变蛋白质分子中特定的氨基酸。

将构建好的突变体文库进行高通量筛选，对正向突变体进行复合突变， 最终获得性能理想的突变体酶拟解决的关键问题：1、木聚糖酶突变位点的选取2、饱和突变文库构建方法3、规模筛选突变体方法

3. 研究的方法与方案

研究方法：根据蛋白质的结构，功能和机制等详细资料对氨基酸序列中要突变的位点进行精确设计， 然后通过点饱和突变对蛋白质分子中特定的氨基酸位点进行改造。

技术路线1、结合出发蛋白结构，与同源耐热蛋白序列与结构进行比对，获得对温度稳定性影响较大的突变位点；2、以毕赤酵母表达质粒ppiczαa为基础，设计点饱和突变引物，构建突变体文库；3、将构建好的文库转入毕赤酵母x33进行表达，获得表达文库；4、通过pcr仪，对表达文库进行热稳定性与最适温度筛选，获得正向突变体；5、正向转化子测序，获得突变位点与突变方向；6、对获得的转化子进行复合突变，最终获得理想的木聚糖酶突变体。

可行性分析1、本课题所涉及到的理论知识、实验方法、操作和技术等已经非常成熟，不存在认识上的缺陷。

4. 研究创新点

对已有的木聚糖酶采用点饱和突变技术进行突变，获得最适反应温度与耐热温度提高的的木聚糖酶。

5. 研究计划与进展

1.2018年3月：设计点饱和突变引物，构建突变体文库并转入毕赤酵母X33进行表达，获得表达文库2.2018年4月：对表达文库进行热稳定性与最适温度筛选，获得正向突变体3.2018年5月：对实验数据信息进行统计分析，得出结果，撰写论文。