F/10家族木聚糖酶突变体表达纯化与动力学测定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

半纤维素是自然界中的一种丰富的再生资源，其中含量最高的部分为木聚糖。

木聚糖的结构一般比较复杂，有很多不同来源，而且每一种来源的木聚糖所含有的糖链结构往往也有很大的差异。

木聚糖酶是一类可特异性降解木聚糖的酶类，在自然界分布很广。

2. 研究的基本内容和问题

目标：表达纯化木聚糖酶，测定木聚糖酶突变体酶学性质与动力学参数， 内容：将突变体进行异源表达，收集获得突变体粗酶液应用亲和层析、分子筛层析等进行蛋白纯化。

测定木聚糖酶突变体酶学性质与动力学参数拟解决的关键问题：蛋白异源高效表达高纯度蛋白获得

3. 研究的方法与方案

研究方法：1通过毕赤酵母表达系统高效表达突变体2通过硫酸铵沉淀亲和层析、分子筛层析对蛋白粗酶液分离纯化。

3 对已纯化的木聚糖酶突变体进行酶学性质与动力学参数测定。

技术路线： 1 将突变体基因插入入ppicz9k质粒中，获得蛋白表达重组质粒2 将重组质粒电转至毕赤酵母gs115感受态中，获得酵母表达工程菌3 通过bmgy发酵培养基培养表达木聚糖酶突变体4 收集发酵液上清，硫酸铵沉淀透析获得粗酶液5 通过ni-nta亲和层析获得初步纯化的蛋白6 通过g75分子筛获得纯化的蛋白7 测定纯化后的蛋白相应酶学性质与动力学参数可行性分析：课题所运用的理论知识、实验原理及方案均已非常成熟，认知方面不存在问题。

4. 研究创新点

木聚糖酶突变体在毕赤酵母内进行表达，将会在酶学性质方面产生变化，具有特异性的功能，经过纯化和动力学测定后确定其改变情况，可根据不同的改变情况确定其实际应用范围。

5. 研究计划与进展

纯化木聚糖酶突变体的表达，预计四月初完成。

对木聚糖酶突变体纯化，预计四月中下旬完成。

蛋白的的动力学测定，预计五月中旬完成。