土壤中“硒-汞拮抗”的机理和影响因素研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 本课题研究意义

1．1 土壤-水稻系统中硒汞作用复杂，其调控机制仍不清楚

硒与金属有较强的亲和力，能与多种有毒重金属元素产生拮抗作用并降低其毒性。自1967年首次提出硒-汞拮抗以来^[1]，环境化学和环境毒理学等相关学科将其归为重要的研究方向之一。针对环境中硒-汞拮抗的研究，尽管已有大量证据表明硒-汞拮抗可能是生物体内降低汞毒性及甲基汞累积的主要原因，但是其具体过程和内在机制仍未完全弄清，尤其是在土壤-植物体系中相关研究还处于起步阶段。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标

通过研究稻田土壤施硒对土壤中汞的活性及甲基化的影响规律，明确稻田土壤氧化还原条件变化过程中生物地球化学因素（温度、ph、eh、铁/硫转化、硒的含量等）对于汞相态、甲基化的影响规律，阐明稻田土壤中影响或控制汞的生物地球化学行为的关键过程和主要控制因素，揭示稻田土壤环境中汞、硒耦合作用机制，以期为汞风险稻田安全利用提供科学的理论依据和技术支持。

2 研究内容

3. 研究的方法与方案

1 研究方法

1.模拟实验：采用便携式哈希多参数水质分析仪（哈希 HQ30d，美国）在厌氧手套包内测定土壤溶液中的pH、氧化还原电位和温度；

2.土壤甲基汞的测定：先经过Cu₂SO₄/HNO₃/二氯甲烷萃取，之后经乙基化反应，最后采用气相色谱分离冷原子荧光（GC-CVAFS，Brooks Rand, USA）测试；

3.土壤中汞的固相形态逐步化学提取，根据Bloom 等（2003）的方法（参见下表）

4.土壤和植物样品总硒及其他金属元素总量分析：先经HNO₃-HF消解，然后用ICP-MS测定；

5.植物样品中甲基汞测定：先经KOH-甲醇溶液振荡消解，经乙基化反应后，采用GC-CVAFS 测试；

6.溶解态总汞、有效态汞、土壤和植物样品总汞，采用MDA-80固液相直接测汞仪（Milestone DMA-80, Italy）测定；

7.可溶硫酸盐（SO₄^2-）的测定：首先用 NaHCO₃（pH= 8.5，NaOH调节）提取土壤中可被微生物所利用的硫酸盐，再使用离子色谱测定（Dionex ICS1100, Thermo Fisher Scientific, UAS）；

8.总有机碳和硫采用元素分析仪（Vario EL cube, Germany）测试；土壤粒度组成采用激光粒度仪测定（Beckman Coulter LS13320, USA）；土壤pH，用10 mmol/L 的CaCl₂溶液浸泡（水土比1:10）30min 后，使用哈希多参数水质分析仪（HQ30D, HACH, USA）测定。溶液中铁使用ICP-OES 测定（Varian710-ES ICP-OES, Agilent, USA）。

9. 土壤中DOC的测定采用氯化钙萃取方法，具体步骤如下：将土壤与CaCl₂2H₂O（0.01 mol/L）以5 mL/g（溶液体积/土壤干重）的比例混合，置于聚丙烯离心管中，并于恒温振荡器中培养30 min（180 rpm，25℃）。将离心管取出离心15 min（4000 rpm）。上清液过0.45 μm滤膜后采用总有机碳分析仪（TOC-5000A , Shimadzu，日本）进行测定。土壤中颗粒性有机碳POC采用UV2310Ⅱ分光光度计进行测定（方法参见HJ615-2011土壤有机碳的测定：重铬酸钾氧化-分光光度法）。

2 技术路线

3 实验方案

3．1 测定土壤基础理化参数和背景值

3．2设置实验组

空白组：添加汞（氯化汞）以汞计算浓度为 2mg/kg；

对照组1：添加硒（Na₂SeO₃），以硒计算浓度 3mg/kg

对照组2：添加汞（2mg/kg），乳酸钠（10mmol/L）增加土壤还原所需电子供体；

添加亚硒酸钠组：在空白组1的基础上加入一定量硒盐（Na₂SeO₃）贮备液，以硒计算浓度 3mg/kg

添加钼酸钠组：在对照组的基础上添加SRB抑制剂钼酸钠（Na₂MoO₄, 20 mmol/L），探究供试土壤中 SRB 细菌对汞甲基化的影响；

添加亚硒酸和钼酸钠组：在添加亚硒酸钠组的基础上添加 SRB 抑制剂钼酸钠（Na₂MoO₄, 20 mmol/L），探究土壤中 SRB 细菌对硒还原的影响

注：每组设置 3 个平行样

3．3实验步骤

1.调pH：所有样品均使用 1 mol/L NaOH的调节pH与本底pH值接近；

2.先向所有处理组添加无机汞，厌氧平衡20d后，再进行处理；

3.厌氧操作：所有处理完成后，混合均匀，加入新鲜超纯水使得水土比为 3:1，加盖拧紧，并使用密实胶带密闭离心管，最后使用真空保鲜机抽真空密封；

4.厌氧培养（模拟水稻淹水）：所有样品避光条件下分别置于 28℃培养箱中，厌氧培养30d；

5.好氧处理：厌氧处理完成后，好氧处理5d，每天打开瓶盖两次（每次 30min），然后在拧紧瓶盖，使样品缓慢氧化5d。3．4样品采集与测定：

1.采集样品：选择培养时间为 0、3、6、10、20、30、35天采集样品，监测不同的培养时间（天数）下各参数的变化；

2.测定步骤：

2.1采用便携式哈希多参数水质分析仪在厌氧手套包内测定土壤溶液中的 pH、氧化还原电位和温度，其中测定的氧化还原电位被转化为相对于氢标准电极电位。

2.2样品取出后在 2500g下离心 20min，然后再次转移至厌氧手套包中，使用 0.45μm 聚醚砜滤膜过滤。

2.3一部分滤液加入盐酸化后保存（0.4% HCl，v/v）用于溶解甲基汞、硫酸根和亚硒酸的测定，其余滤液加入硝酸酸化（2% HNO3，v/v）保存，用于铁和无机汞的测定。相应固体土壤样品分装，用于、甲基汞含量、含水率、SRB以及HCl提取态铁的测定。所有土壤样品置于-20℃冰箱内冷冻存放，以备分析使用。

3．5 理化分析

土壤甲基汞的测定、汞的固相形态逐步化学提取、土壤和植物样品总硒及其他金属元素总量分析、植物样品中甲基汞测定、溶解态总汞、有效态汞、土壤和植物样品总汞、可溶硫酸盐（SO₄^2-）的测定、总有机碳和硫等的具体测定方法参见研究方法。

3．6 数据分析

实验数据的统计分析均采用SPSS16.0 软件，完成单因数方差分析（one-way ANOVA）、多因素方差分析（two-way ANOVA）和配对t检验分析，显著性水平p = 0.05，其中单因数方差分析分别使用Tukeys HSD (honest significant difference)或Dunnett多重比较检验方法。

4 可行性分析

4．1 实验材料

供试土壤来自中国科学院南京土壤所采集的全国不同性质的20种土壤，且土壤基本参数均已测定，为之后进行土壤中硒对汞的转化及生物有效性的影响及作用机制的研究打下了良好的基础。土壤种类丰富，性质各异，也为研究硒-汞拮抗作用的普遍意义提供了大量的原料，更具有现实意义。

4．2 实验器材

实验室器材完整，包括氧化还原电位（ORP）去极化法自动测定仪（FJA-6，传滴仪器，中国）、便携式哈希多参数水质分析仪（哈希 HQ30d，美国）、厌氧手套包、气相色谱分离冷原子荧光（GC-CVAFS，Brooks Rand, USA）、MDA-80固液相直接测汞仪（Milestone DMA-80, Italy），重点实验室配备ICP-MS、GC-CVAFS、离子色谱测定（Dionex ICS1100, Thermo Fisher Scientific, UAS）、元素分析仪（Vario EL cube, Germany）、激光粒度仪测定（Beckman Coulter LS13320, USA）、ICP-OES 测定（Varian710-ES ICP-OES, Agilent, USA），保证理化分析的顺利进行。

4．3 实验方法

实验室拥有丰富的土壤-植物体系中硒-汞作用的研究经验，且始终站在行业内的研究前沿，多年来积累的经验可以保证本项目达到预期目标。

4. 研究创新点

1.研究思路创新：室内模拟水稻根际环境的实验，设置不同处理组，探讨稻田施硒对稻米中汞累积的调控效应及相关机理。室内实验有助于解释室外观测现象，能进一步验证并揭示水稻根际环境中硒对汞的转化及生物可利用性影响的内在机理。

2.丰富了稻田环境（湿地环境）中汞硒相互作用的相关理论：从不同角度阐述了硒对汞生物有效性的影响主要缘于土壤中硒汞相互作用，初步揭示了汞的生物有效性（活性）的降低受控于土壤中硒的含量变化及还原过程，即硒还原产物与无机汞作用可形成难以被生物所利用的硒汞化合，从而降低了无机汞生物有效性，而且硫酸盐含量变化对上述这一生物地球化学过程受影响可能是非常有限的。

5. 研究计划与进展

研究计划

2017年2月：文献资料分析、整理，制定详细的研究方案；

2017年3月2017年5月：进行水稻际环境模拟实验，同时按照具体实验方案进行厌氧-好氧交替实验，定期采集土壤样品，经处理后测定土壤样品中的甲基汞、溶解态总汞、铁、溶解性硒、可溶硫酸盐（so₄^2-）、srb等的含量；