1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 1.1本课题意义 万物土中生[1]，土壤是人类赖以生存的基础！许多国家都存在土壤有机污染问题。在我国，有机污染土壤面积十分庞大，多环芳烃（PAHs）已成为土壤环境中常见的一类重要污染物[2-4]，其疏水性强、难于降解、易在土壤中累积，严重危害农产品安全和人群健康。多环芳烃（PAHs）等有机污染物多具有三致效应，即致癌、致畸、致突变的作用，可通过空气或水进行长距离输送，参与全球和各圈层的循环，并在土壤中累积，通过食物链富集进而威胁人群健康[5-7]。土壤有机污染已成为当前限制我国农产品国际贸易和经济可持续发展的重要障碍之一[8,9]。土壤有机污染问题已引起世界上许多国家的普遍关注[10，11]。另一方面，我国耕地资源十分紧张，污染土壤已占耕地面积的1/6 以上；当前急需要解决的一个重要科学问题是如何调节植物对有机污染物的吸收积累作用、以在污染区生产安全农产品、防止污染物在农作物中积累、降低土壤污染对人们健康的危害！ 本项目筛选具有PAHs降解特性的植物内生细菌。本研究选择芘为目标污染物，从多环芳烃污染场地采集植物，旨在从植物体内分离筛选能以芘为唯一碳源和能源的高效芘降解细菌，并探索其在不同环境条件下对芘的降解能力，以期为利用芘降解特性植物内生细菌防治土壤污染提供菌种支持。芘是由四个苯环对称排列组成的稠环芳烃，结构稳定，是PAHs中一种典型的难降解高分子量代表化合物，被作为监测PAHs污染的指示物和其它PAHs光化学降解、生物降解的模型分子之一[12]。具有降解特性的植物内生细菌的发现，为降低植物PAHs积累开阔了思路[13]。研究表明，具有降解污染物特性的植物内生细菌可以改变土壤有机物在植物体内的归宿，从而影响污染物在植物体内的积累[14,15]。植物内生细菌具有丰富的生物多样性[16]。不仅可通过调节植物体内激素、酶的分泌影响植物体内物质代谢[17,18]，同时植物内生细菌可改善植物营养[19]、降低植物病菌感染[20]、提高植物抗逆性[21]等。这对于保障污染区农产品安全、减低农作物污染风险、合理利用污染土壤资源等意义重大。 1.2国内外研究概况 PAHs类化合物是土壤环境中普遍存在的具有代表性的一类有机污染物。近些年来，有关植物内生细菌的环境效应已成为国内外环境领域研究的一个热点。2004年，Idris 等[22]从超积累植物体内筛选了抗镍内生细菌，发现茎秆中内生细菌主要为Cytophaga、Flexibacter、Bacteroides，根系中内生细菌的优势种则为Methylobacterium、Rhodococcus、Okibacterium，它们均可提高植株对镍的耐性。2010年，Sun等[23]从铜矿区油菜体内筛选出内生细菌JL35、YM22、YM23。Sheng等[24]从生长于重金属污染土壤上的油菜中分离出2株内生细菌，证实其可提高植株对铅的吸收。2009年，Ho等[21]从芦苇、番薯和香根草中分离出188株内生细菌，证实了其中一些内生细菌提高了植株对芳香烃化合物污染的抗性。Phillips等[25]报道，内生细菌Pseudomonas spp。占优势时植物降解烷烃类污染物的能力提高,Brevundimonas和Pseudomonas rhodesiae占优 |
势时植物降解芳香烃类的能力提高。一些内生菌可增强超积累植物对土壤中污染物的富集能力、进而提高污染土壤植物修复的效率[26]。 近来，有研究者报道[21]，内生细菌Achromobacterxylosoxidans F3B可以提高多环芳烃污染土壤上植株的根长、生物量，增强植株对多环芳烃污染的耐受性。最近，申请人所在实验室则从生长于石油污染土壤上的植物体内分离筛选出了具有菲、芘降解特性的内生细菌菌株7J2和12J1，并表征了其生物学特性。也有学者推测，筛选具有降解特性的植物功能内生细菌、并将其定殖在目标作物上，有望提高植物对有机污染物的降解作用[9,27]。遗憾的是，总体来看，国内外关于内生细菌对植物吸收有机污染物的调控作用的研究方兴未艾，有关不同污染物的功能内生细菌的筛选、定殖、功能表征及机理等诸多问题亟待探索。实际上，迄今有关PAHs的植物功能内生细菌的研究才刚开始，仅涉及了极少的几株内生细菌和几种PAHs，且其调控植物吸收的功效及机理等尚远不清楚，急需要运用多学科的知识和手段来共同解决该领域一些重要科学问题：具有PAHs 降解特性的植物功能内生细菌的分离、筛选与定殖；功能内生细菌对植物吸收积累PAHs 的调控作用；功能内生细菌对植物体内酶系活性的影响及其与植物代谢PAHs的关系；功能菌调控植物吸收PAHs的作用机制。 1.3应用前景 植物内生细菌是指能够定殖在植物健康组织间隙或细胞内，并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物[28]。植物中内生细菌种类繁多、分布广泛。几乎所有的健康植物体内均存在有大量的内生细菌，其具有丰富的生物多样性[16]。一般认为内生细菌是植物组织内的正常微生物菌群，其存在不会使植物出现可见的伤害或功能的改变。目前，国内外已在小麦、玉米、棉花、水稻、马铃薯、甜菜等近30种作物中分离出内生细菌129种，隶属于54个属，并发现了内生细菌新的分类单位[29]。不同植物体内内生细菌的种类与数量差异明显，甚至同种植物不同品系植株内内生细菌种类、数量和活性也存在差异[30]。尽管内生细菌在植物不同部位均有分布，但通常下部组织多于上部，越往植株顶部，内生细菌越少。随着植株生长时间延长，其体内的内生细菌种类和数量也逐步增多，在生长茂盛时期其数量和种类达到最大[31]。植物内生细菌已成为农学、植物保护、园艺、环保等领域共同关注的一类颇具前景的重要微生物菌群。 自上世纪50年代以来，研究者开始关注植物内生细菌对高等植物生长的影响[32]；研究发现，植物内生细菌在植物体内生长繁殖过程中可产生生长素、酶类等次生代谢产物，影响植物体内的激素水平，从而调节植物代谢，促进植物生长，提高植物耐受性[18,33-34]。植物也可为内生细菌提供稳定的生存环境和大量的营养物质[35]。已证实，植物内生细菌具有促进作物增产、提高植物抗逆性、降低植物病虫害发生等生理生态功能，并可作为生防菌和外源基因的重要载体。与从土壤中分离的根围促生细菌相比，植物内生细菌能有效地在植物体内定殖，不易受外界环境的影响，诱导植物产生抗菌素、酶类等次生代谢产物及生成含铁细胞等，促进植物生长，提高植物的耐受性[18,36]；另一方面，植物为内生细菌提供了生存场所和大量营养，刺激内生细菌的生长繁殖[35]。 |
针对上述情况，本项目以PAHs中的芘为目标污染物，从多环芳烃污染场地采集植物，旨在从植物体内分离筛选能以芘为唯一碳源和能源的高效芘降解细菌，并探索其在不同环境条件下对芘的降解能力，以期为利用芘降解特性植物内生细菌防治土壤污染提供菌种支持，探索出一条应用植物体内的微生态系统来有效规避有机污染风险的新途径，进而为防治土壤有机污染、保障污染区农产品安全、减低农作物有机污染风险、合理利用污染土壤资源等提供重要依据。
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2. 研究的基本内容和问题
2.1研究目标 分离、筛选、鉴定出具有PAHs 降解特性的植物功能内生细菌，旨在从植物体内分离筛选能以芘为唯一碳源和能源的高效芘降解细菌，并探索其在不同环境条件下对芘的降解能力，以期为利用芘降解特性植物内生细菌防治土壤污染提供菌种支持，提出应用植物体内的内生细菌来有效规避作物有机污染风险的途径和思路，为防治土壤有机污染、保障污染区农产品安全、减低农作物有机污染风险、合理利用污染土壤资源等提出建议。 2.2研究内容 具有PAHs 降解特性的植物内生细菌的筛选； 在PAHs 污染区采集不同来源、种类和性状的植物样品，采用平板稀释分离法和平板划线法，分离纯化植物内生细菌；通过菌体形态观察、生理生化指标鉴定，结合16S rDNA 基因序列同源性分析，鉴定筛选出植物内生细菌。 通过平皿促生试验法，筛选出能促进植物生长、且具有PAHs 降解特性的植物功能内生细菌，采用16S rDNA基因序列同源性分析、确定其分类学地位。 2.3拟解决的关键问题 （1）分离、筛选、纯化内生细菌，保证得到纯种内生细菌。 （2）鉴定菌种，分析其生化性质；筛选出有芘降解功能的植物内生菌。 |
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法与实验方案 |
在典型PAHs污染土壤上，采集不同来源、性状（如生长期、长势）的8~10种主要代表性植物样品，根、茎、叶分别取样。采用平板稀释分离法和平板划线法，分离纯化植物及其不同部位的植物内生细菌；具体过程是，将采回的植物样品按下列程序表面消毒：自来水冲洗→75%酒精漂洗(3～5min) →无菌水冲洗3～4 次→0.1%HgCl2 漂洗(2～5min) →无菌水冲洗5次。将植物样品移入无菌研钵，用灭菌剪刀剪碎后，加入无菌水，充分研磨。静置，取上清液梯度稀释并涂布有氮培养基平板，培养48h。待平板上长出菌落，用平板划线、稀释等分离方法，经过分离、筛选、纯化的反复过程，直至得到纯化的内生细菌菌落。从纯化平板上的菌落形态来观察细菌的群体形态特征，通过革兰氏染色、芽孢染色观察细菌的个体形态特征；测定分离出的内生细菌菌株的生理生化指标（东秀珠，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001）；参照文献方法（何红等，微生物学报，2004；陈维信等，果树学报，2007）进行16SrDNA基因序列同源性分析。明确PAHs污染下植物内生细菌的种群特性。
在上述结果的基础上，通过平皿促生试验方法（陈小兵等，环境科学学报，2008），筛选出能促进植物生长、且具有PAHs降解特性的植物功能内生细菌，PAHs选用芘。具体过程如下：制备一系列不同芘浓度污染土样；每个平皿称取30 g污染土样，设种植物且接菌、种植物不接菌、不种植物且不接菌等多组处理。植物（黑麦草）种子经2%的次氯酸钠溶液消毒10min后，置于培养箱中催芽，播种于污染土样中。接菌处理每平皿接1mL 菌悬液(其OD值为1.0)。10~30d采样，测定土壤和植物中芘的含量 (宋玉芳等, 应用生态学报，1995；Gaoet al, Plant and Soil, 2008)
。通过试验结果比选，筛选出目标功能内生细菌。
3.2技术路线 3.3可行性分析 （1）本研究具有重要的科学意义和实践价值，研究成果丰富了植物内生细菌的利用途径，为利用植物内生细菌修复多环芳烃污染的土壤提供依据。 （2）本研究具有良好的基础，在实验之前各成员已经通过查阅文献对研究课题有了充分的了解。 （3）本项目拥有良好的软硬件设施，课题组实验室拥有试验所需的各项实验器材，各种试验用品准备齐全。 （4）本项目的技术路线成熟可靠，已有大量帅选植物内生菌的成功案例。 （5）本项目的指导教师近年来开展了大量相关研究工作，在本课题研究方向已积累大量的经验，能够在以后的研究工作中起到很好的指导作用。 |
4. 研究创新点
本项目在实验室前期研究工作的基础上，分离、筛选、鉴定具有 PAHs 降解特性的植物功能内生细菌，弄清其在植物体内的定殖性能，有望丰富PAHs功能菌库，并可为其它有机污染物的植物功能内生细菌的筛选提供参考。 |
5. 研究计划与进展
5.1研究计划 2013.12 扬子石化采样 2013.12-2014.01 摇床富集培养 2014.02-2014.03 植物内生细菌分离纯化实验，得到单菌落，测其降解效果 2014.03-2014.04 菌株鉴定分析及条件优化 5.2预期进展 通过开展本项目研究，分离、筛选1~2 种具有PAHs 降解特性的植物功能内生细菌，明确其分类学地位，弄清其在植物体内的定殖性能。提出应用植物体内的内生细菌来有效规避作物有机污染风险的途径和思路。 |
