三种草本植物对石油污染土壤的修复效果研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

随着现代工业的迅速发展，石油污染的问题愈加严重，作为人类最直接的活动区域，土壤污染的形势日益严峻。土壤的石油污染已经成为一个严峻的世界问题，石油污染的土壤亟待修复。植物修复因其绿色、环保、符合可持续发展要求等优点迅速引起了广泛的关注，而成为修复石油污染土壤的首要选择。

土壤修复技术包括物理、化学和生物修复技术[1,2]。由于物理、化学修复的不可控性和高昂的成本，土壤污染很难得到有效的治理。不仅如此，还容易造成二次污染，通常不采用以上两类修复方法。而生物修复技术以资源投入少、造成二次污染的可能性低等优势，被认为是环境友好型的修复方式，因此受到更广泛的关注和研究[3]。生物修复是利用植物、动物或微生物降解、去除、稳定或转化污染物的生物修复过程[4,5]。

植物直接吸收代谢机制在植物修复过程中发挥主要作用。植物直接吸收和代谢机制包括植物提取修复、植物降解修复、植物挥发修复以及植物固定修复[6,7]。 （1）植物提取是指植物根部转移或浓缩土壤中的有机污染物进入植物的地上部分（茎和叶）一种植物修复方式。（2）植物降解是指植物从土壤中吸收有机污染物并对其进行催化降解一种植物修复方式。（3）植物挥发是指植物从土壤中吸收并转运某些小分子物质，然后利用叶片的蒸腾作用将其释放到大气中的一种植物修复方式[8,9]。（4）植物固定是指植物通过根部积累或根区内的沉淀来稳定污染物来降低污染物对人类健康和环境的风险的一种植物修复方式。根际修复机制在植物修复过程中起辅助作用。植物根际环境中存在大量的根系分泌物和根际微生物，它们不仅能够有效降解石油污染物，还能与植物产生协同作用，帮助植物降解石油污染物，提高修复效率。（1）根际分泌物包括低分子分泌物、高分子分泌物和酶类能有效提高植物的修复效率。（2）因植物根部有来自植物光合作用而产生的有机物，土壤中的微生物在植物的根际聚集。而根际微生物能分解土壤中的有机物供植物利用[10]。植物因此从微生物作用中获取更多的营养物质，提高在逆境中的生存能力。

石油烃作为早期有机污染物修复研究的对象，已成为植物修复研究领域的重点对象。当前寻找环境适应能力强、具有石油耐受性且修复效率高的植物是石油污染土壤修复的关键。目前，有大量研究表明植物已经成功的应用于土壤石油污染生物修复[11,12]。如 Wiltse等[13]研究表明在石油浓度为20 g/kg的污染土壤中，不同品种的紫花苜蓿（Alfalfa）对石油污染土壤具有不同的清除潜力。张金等[14]对石油污染土壤盆栽修复试验的研究结果显示，黑麦草对石油的耐受性最强，紫茉莉次之，玉米最差；在10 g/kg石油浓度下三种植物的石油降解能力最大。根际微生物强化植物修复效果的研究也取得了一定的进展，焦海华等[54]研究表明在石油污染中土壤中种植棉花显著提高了根际土壤微生物活性，在一定程度上改变了微生物的群落结构，显著提高了土壤石油烃的去除率。

2. 研究的基本内容和问题

2.1工作假说 通过查阅大量国内外文献，总结当前应用于石油土壤污染修复的植物种类的形态结构及生理特点，发现这些植物普遍具备以下特点：（1）成本低；（2）根系发达；（3）生物量大；（4）适应环境能力强；（5）不影响人类健康；（6）改善生态环境。

根据以上总结，我们选取了三种具备优势的草本植物：（1）高羊茅—根系发达、适应能力强，现有研究表明其对重金属和石油具有极好的去除能力；（2）籽粒苋—地上部生物量大、侧根发达；（3）甜象草—生长速度快、根系发达、生物量大。

通过设计实验方案对以上三种草本植物的修复效果作出验证，并将理论与以往经验相结合，提出如下科学假说： 三种草本植物均对石油污染表现出一定的耐受性，对石油污染物具有一定的去除效果；不同石油浓度下，同一植物会表现出不一样的抑制效果，植物的发芽率、生物量、生理机制及石油去除效率会受到石油不同程度的影响，根据甜象草生长速度快的特点，短时间内生物量会比较大，修复效果可能更好。

3. 研究的方法与方案

3.1研究材料本研究材料为甜象草（Pennisetum purpureum Schum ev.）、高羊茅（Festuca arundinance）、籽粒苋（Amaranthus hypochondriacus L.）3.2研究方法和手段（1）植物培养和处理方法 将采集的新鲜土壤放在阴凉通风处自然风干，风干后用木槌捶碎，挑出小石块、动植物残体等杂质，过4 mm筛，充分混匀。取少量土壤测定土壤TPHs浓度，取盆栽实验前的空白土壤测定其含水率，测定土壤的基本理化性质如pH、EC、有机质SOM、速效磷、速效钾和碱解氮等。 将原油与过筛后的清洁土壤按照不同比例充分混合，配制成4组污染浓度水平，依次为：0%（空白对照）、5%、10%、20%。原油以二氯甲烷作有机溶剂按照1:1的比例混合后，均匀喷洒在清洁土壤上并搅拌均匀。自然风干两周，待二氯甲烷完全挥发后，分别将不同石油浓度的土壤再次搅拌混匀，采集不同浓度的石油污染土壤测定实际总石油烃浓度。 将混好的石油污染土装盆并做好标记，浇水，平衡两周后播种。每盆1.5 kg石油污染土，选择颗粒饱满、大小相近的种子播于聚乙烯盆中，每盆播种40粒。为了简便，以添加到土壤中石油的百分数及植物中文名称的拼音首字母做标记。（2）三种草本植物的生理指标的测定a. 种子发芽率的统计待植物发芽情况稳定后，统计每盆种子的发芽数并计算发芽率，计算公式如下：发芽率(%) = (发芽数/播种粒数)×100b. 植物生物量的测定 60 d后采取各完整的植物体，尤其要注意把植物根部采集完全。将植物表面的土冲洗干净后，用吸水纸将多余水分吸干。植物体分地上部和地下部剪开，分别称鲜重（FW）；然后在105 ℃下烘箱中杀青30 min，75 ℃下烘干至恒重，分别称干重（DW）。c. 植物氮磷钾含量的测定 烘干后的植物样品经磨碎、过筛，待测。氮的测定采用H2SO4-H2O2消解法，植物常量元素测定方法参考鲍士旦《土壤农化分析》，流动注射分析仪测定；P、K的测定采用HNO3-ICP测定法。d. 植物可溶性蛋白的测定 采用考马斯亮蓝G-250法测定植物可溶性蛋白含量[15]，标准曲线的制作用牛血清蛋白。称量新鲜的植物叶片0.5 g于研钵中进行研磨并加入2 mL蒸馏水，研磨至呈匀浆状态，然后转移至离心管中，用6 mL蒸馏水分次冲洗研钵，冲洗液均转移到同一离心管中，静置并自然冷却30 min，然后放于离心机内，在4000 r/min的转速下离心20 min，取一干净的10 mL容量瓶，将上清液转入并用蒸馏水定容至刻度线，即得蛋白质提取液。取一干净的具塞刻度试管，加入蛋白质提取液0.1 mL，加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂5 mL，充分混合，静置放置2 min，以空白作对照，用1 cm光径比色杯在595 nm波长下用紫外分光光度计测定其吸光度。根据标准曲线，计算样品中可溶性蛋白含量。e. 植物可溶性糖的处理 采用蒽酮比色法[16,17]进行植物可溶性糖含量的测定，标准曲线的制作用蔗糖标准液。称取0.1 g新鲜植物叶片，置于一干净的25 mL刻度试管中，加入5 mL蒸馏水，用保鲜膜封口，放在水浴锅中进行沸水浴30 min（提取两次），过滤所得提取液于25 mL容量瓶中，用去离子水冲洗试管3~5次并将冲洗液置于同一容量瓶中，定容至刻度，即得提取液。取一干净的20 mL刻度试管，加入提取液0.5 mL，再加入蒸馏水1.5 mL，然后按顺序加入蒽酮乙酸乙酯试剂0.5 mL和浓硫酸5 mL，充分振荡并摇匀，立即将试管放入沸水浴中准确保温1 min，取出后自然冷却至室温。以空白作参比，在630 nm波长下用紫外分光光度计测定其吸光度。根据标准曲线，计算样品中可溶性糖含量。（3）三种草本植物对石油污染土壤修复效果的测定a.土壤理化性质的测定取足够的蒸馏水，加热至沸腾并使其沸腾20 min，即得到无CO2水。冷却至室温，将风干土和无CO2水按照1:5的比例混合于干净的锥形瓶中，置于摇床上振荡30 min。静置30 min后，用校准好的pH计测定pH，用电导仪测定电导率；用重铬酸钾容量法—外加热法测定有机质；用碱解扩散法测定碱解氮；用0.5mol/L NaHCO3法测定速效磷；用NH4OAc-ICP法测定速效氮。b.总石油烃的测定 重量法。测定方法如下：采集的土壤样品经冷冻干燥后，研磨并过20目筛，备用。称取2.5000 g土样于50 mL离心管中；加入20 mL二氯甲烷，摇匀；将离心管放入超声波设备中，超声处理15 min；然后将离心管放入离心机中于2000 r/min的转速下离心5 min，取出上清液。重复上述步骤2次，将两次提取的上清液合并，过层析柱（下层2 g硅胶，上层2 g无水硫酸钠）进行固液分离，并用5 mL二氯甲烷溶液洗脱。取干燥的旋转蒸发瓶称好重量，记为M1，将层析柱过滤得到的萃取液和洗脱液均置于旋转蒸发瓶中，于旋转蒸发仪上40 ℃恒温浓缩，当旋转蒸发瓶底部剩余约1 mL二氯甲烷时，旋蒸终止，取出旋转蒸发瓶并擦干外壁水分，放入鼓风干燥箱内，在70 ± 2℃下烘干2 h，然后置于干燥器内冷30 min后称重，记为M2。烧瓶前后的质量之差即为土壤中所提取的石油污染物的质量。按照下列公式对土壤中总石油烃的浓度进行计算：土壤总石油烃浓度(g/kg)=(M2-M1)×103/m式中：M1----旋转蒸发瓶重量(g)M2----旋转蒸发瓶和石油重量(g)m----土样质量(g)（4）三种草本植物对根基微生物影响的测定a. 样品采集 采集修复时期为60 d的新鲜植物根际土，每一处理采三盆。根际土壤取样采用“抖根法”[18]，先从土壤中把植物根系挖出，将根际表面较松散的土抖掉，采集附着在植物根系0~4 mm的土壤，挑出根系等杂质并混匀，装在塑封袋中于冰箱（-80℃）内冷冻保存。b. 样品处理

选取石油污染水平分别为0%、10%、20%的根际土土壤样品，为了简便，以石油污染的百分数及植物中文名称的拼音首字母做标记：T为甜象草，G为高羊茅，Z为籽粒苋，并按照N（植物名称简写，对照组省略）-X（石油污染水平X%）-Y（样本编号，取值1~3）的格式进行编号。

4. 研究创新点

目前关于甜象草、籽粒苋、高羊茅3种植物的报道多是作为超富集植物修复重金属污染土壤的研究，而对其修复石油污染土壤的潜力的研究却很少。

且关于石油污染植物修复的研究中，普遍只分析土壤总石油烃含量，忽略了植物修复对土壤理化参数的影响，本文对土壤的pH、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾等进行了比较与分析，能够为将来植物修复土壤层面的分析提供理论依据。

5. 研究计划与进展

5、进度安排（包括论文撰写）2019.09-2019.10 查阅相关文献，确定实验方案。

2019.11-2020.01 60d温室栽培。

2020.02-2020.03 受新冠肺炎影响，停止实验2020.04-2020.05 测定相关指标，分析相关指标数据，开始撰写论文及报告，论文答辩等。