SnRK1蛋白激酶在响应环境变化中的功能分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献）

植物中的snrk1蛋白激酶是一类在响应环境胁迫、维持植物稳态与调节新陈代谢方面有着重要作用的三元聚合体酶，包括具有有催化活性的α亚基和具有调节作用的β、γ两个亚基共同组成。α催化亚基是snrk1蛋白激酶的实现功能的最主要部分，具有高度保守性。α催化亚基由激酶结构域和调节结构域组成，激酶结构域包括一个典型折叠结构和一个起磷酸化作用的激活环，调节结构域包含一个与泛素相关的结构域(uba) ，可以调节与泛素化蛋白的相互作用。β亚基连接了α亚基和γ亚基，含有两个结构域。β亚基由一般可变的n端（ntr），中部的碳结合域cbd( glycogen-binding domain)和尾部的c端组成。其中，酵母细胞中的β亚基n端的乙酰化修饰或者构象的变化使得β亚基的定位发生变化，可以用于激酶的亚细胞定位；cbm结构域是实现与α亚基互作的结构域；c端含有与γ亚基相互作用的asc结构域n( association with the snf1 complex)，在植物中特有的β3亚基缺少cbd结构域，其asc结构域可以同时与α亚基、γ亚基互作。γ 亚基存在着多变的n端，而c端主要由4个cbs( cystathionine-β-synthase) 组成，可与α亚基上的腺苷酸绑定调节催化亚基的活性。在植物中存在一种特有的亚基 kinβγ，n 端与β亚基的保守结构域同源并且融合了一个cbd结构域，c端与γ亚基同源，发挥γ亚基的功能。

snrk1 活性的调节包括主要的上游激酶以及磷酸酶的直接调节与泛素化、sumo调节、激素调节等。研究表明snrk1激酶需要磷酸化激活激酶活性，主要通过上游激酶进行磷酸化修饰α亚基的t-loop环上的氨基酸来实现，磷酸化调节被认为是snrk1活性调节的主要方式。在通常情况下，高浓度的葡萄糖环境条件会抑制激酶的磷酸化，磷酸化酶会维持α亚基的t-loop环上氨基酸残基的去磷酸化状态，从而使其失活；在转移至低葡萄糖环境下（胁迫状态下），对应的α亚基上的氨基酸残基被磷酸化修饰，令激酶复合体激活。对于拟南芥的研究发现，snrk1的上游激酶与修饰位点分别为grik1, grik2与t175，t176，也有对水稻研究发现，cipk15也是snrk1的一个上游激酶。高浓度葡萄糖条件会使磷酸酶发挥去磷酸化作用，维持去磷酸化状态。在酵母中，reg1-glc7 蛋白磷酸酶 1、2a类型蛋白磷酸酶sit4会以蛋白互作的方式维持snf1复合体α催化亚基活化环中的去磷酸化；ampk的体外实验表明 可以被 pp1、pp2a 和pp2c磷酸酶去磷酸化，其中pp1和pp2c去磷酸化的效率要高于pp2a；在植物中，pp2c 磷酸酶、abi1 和 pp2ca 可以跟snrk1α1 互作使之去磷酸化，也有体外研究发现，pp2c74也可以跟snrk1的α2催化亚基互作，实现去磷酸化调节。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

研究目标与内容：

（1）创制snrk1家族基因的突变体

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法：

（1）茎蘖数及穗部性状数据统计分析

（2）水稻杂交

（3）DNA粗提取

（4）PCR

（5）Sanger 测序

技术路线：

试验方案：

（1）SnRK1家族基因的突变体创制

杂交材料种植：将突变体材料snrk1a，k3k4播种移苗，田间每个材料插两行，每行10株，并播种移栽日本晴材料作为杂交的另一亲本材料，为保证亲本花期相遇，日本晴材料分期播种，间隔期为10天，共播3批。

在亲本花期相遇期间进行杂交实验，选取合适的父母本材料，将未开花母本小穗上部减去1/3，用镊子小心取出6枚完整雄蕊，套袋以防止花粉散落在柱头上。次日11点至14点间，将即将开放的父本花药轻轻在剪去颖壳的母本小花柱头上方抖动，使花粉散落在母本柱头上，授粉后，将母本稻穗继续套袋，并在表面注明父母本及授粉时间。授粉约两周后，观察小花发育情况，若授粉小花内的子房已经膨大，则杂交成功。

（2）突变体对氮肥和密度的响应

种植材料

materials

小区种植：田间试验设置2个施N水平,设置0kg（LN）和300kg N/ha（HN）两个施氮水平，设置1:1:2（基肥:分蘖肥：穗肥=1:1:2施用）氮肥运筹处理，磷钾肥施量分别为P₂0₅150kg/ha及K₂0 240kg/ha，每个突变体（表格中）及其对应的WT各种植1.5m×1.5m小区，设置两个种植密度（30cm×15cm，15cm×7.5cm），1穴1苗。

测定指标：移栽至拔节期，每7天记录一次茎蘖数；于抽穗期测量株高（若株高差异显著，统计节间长度）；于成熟期考察穗结构（一次枝梗/颖花，二次枝梗/颖花），穗长，统计穗重，千粒重，结实率等产量数据。

可行性分析：

SnRK1对植物碳氮代谢有十分重要的功能。前人研究表明，在植物的氮代谢过程中，SnRK1可以诱导与氮代谢过程中蛋白酶的表达起到调节作用；而在碳代谢中，SnRK1A能够调进行磷酸化修饰激活促进淀粉分解产生能量维持植物体内的能量供给。施用不同水平氮肥及改变其种植密度能够改变植株体内的碳氮代谢进程，比较SnRK1的缺失变体与野生型相关指标的变化，有助于明确SnRK1在碳氮代谢过程中的功能，提高碳氮利用水平，进而提高水稻产量与品质。

4. 研究创新点

特色或创新之处

本试验采用snrk1缺失变体作为试验材料，比较它们对于不同氮肥水平及种植密度条件的响应。并通过杂交获得双突及多突材料，进一步揭示水稻三个snrk1基因的功能及调控碳氮代谢的机制。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

通过杂交技术获得SnRK1多突变体，对碳氮水平的响应以明确基因的功能及调控机制，进而发掘以SnRK1为核心的碳氮代谢调控网络。