玉米光合基因细胞特异性表达及其组蛋白修饰特征的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

研究背景玉米是全球第一大粮食作物。作为c4植物，玉米具有高光合效率的特点。玉米是二倍体，玉米基因组大小约为2500mb，与人类相当，为拟南芥的20倍，大约包含50000个基因[1]。相对于已经完成基因组测序的水稻，拟南芥来说，玉米基因组结构最大的特点是包含大量的转座子，这些转座子非均匀分散于整个基因组中的几百个转座子家族，其转座子在基因组内形成高度重复，占基因组60%-85%，这类重复的元件和基因是玉米基因组较大的原因[2]。光合作用是将光能转变成电能，之后转化为活跃的化学能，最后转变成稳定的化学能储存在糖类中的过程。光合作用是维持植物体生长和发育最重要的生命活动，地球上的生命都依赖于光合作用，高等植物的光合作用可以分为c3，c4，cam三大类。c3光合途径（卡尔文循环）吸收co2主要分为3个阶段：羧化阶段，还原阶段，再生阶段[3]。在羧化阶段，核酮糖-1,5-二磷酸（rubp）在核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）催化下与co2结合，生成的产物很快水解成为2分子3-磷酸甘油酸（3-pga）。核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）不仅能结合co2，还能与o2反应，导致光呼吸作用，从而消耗被同化了的碳。在还原阶段，3-pga由3-磷酸甘油酸激酶催化，并且利用光反应产生的atp，磷酸化形成1,3-二磷酸甘油酸（1，3-bpga），3-bpga在3-磷酸甘油醛脱氢酶催化下被光反应产生的nadph还原成为3-磷酸甘油醛（3-pgald），co2被还原成了糖（3-pgald）。在再生阶段，绝大部分的3-pgald通过一系列的催化反应又转变为rubp[4]。c4植物的碳同化过程基本可分为四个阶段：第一步，在叶肉细胞中通过磷酸烯醇式丙酮酸（pep）的羧化作用形成c4二羧酸（苹果酸或天冬氨酸）固定co2；第二步，c4二羧酸由叶肉细胞通过胞间连丝转运到维管束鞘细胞内；第三步，在鞘细胞内c4二羧酸释放co2，此co2进入pcr循环被还原成糖；第四步，脱羧形成的c3（丙酮酸或丙氨酸）被转运回叶肉细胞，并再生出co2的受体pep[4]。c3植物与c4植物一个主要的区别在于叶肉细胞的结构，玉米等c4植物的叶片中维管束被一圈特化细胞-维管束鞘细胞所包饶，维管束鞘细胞及其内含叶绿素都比叶肉细胞大，像一个花环围绕着维管束，形成c4植物特有的“花环结构”，而c3植物维管束鞘细胞无叶绿体；c4植物维管束鞘细胞的叶绿体基粒退化，这些叶绿体只含间质片层，成为暗反应的专用场所。植物维管束鞘细胞周围是叶肉细胞，c4植物的叶肉细胞中叶绿体小，基粒类囊体多，积累淀粉少，说明其主要进行光反应阶段。c4植物叶肉细胞没有海绵和栅栏组织之分，所有叶肉细胞部位均可进行气体交换，并且维管束鞘细胞与叶肉细胞排列紧密，两者之间有发达的胞间连丝贯穿[5]。c4光合途径中最为关键的三个酶分别是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（pepc）、丙酮酸磷酸二激酶（ppdk）和nadp-苹果酸酶（nadp-me）。pepc是一种广泛存在于高等植物，藻类，光合细菌、蓝细菌以及大多数非光合细菌中的裂解酶，在高等植物中存在于叶肉细胞的细胞质中。c4植物pepc基因家族共有三个成员组成，其基本结构相似，分别是c4型（绿叶型）、根（茎）型、黄化叶型或c3型[4]。玉米pepc基因的三种类型分别位于不同的染色体，c4型位于第九染色体，c3型位于第七染色体，根型位于第四或第五染色体[6]。ppdk基因是由一个基因在两个启动子控制下从两个不同的起始位点开始转录的，由第一个启动子起始转录产生较大的转录物，编码c4型ppdk，位于叶肉细胞的叶绿体中，催化co2最初受体pep的再生，该酶催化的反应是c4代谢途径中的限速步骤，在c4植物的叶片中ppdk酶活性严格受光调控，在黑暗条件下该酶活性降低，而光照时其活性迅速提高。[19]nadp-me（依赖于nadp的苹果酸酶）有两种类型：光合型和非光合型，光合型主要存在于叶绿体中，它的表达受光的调节，主要功能是催化苹果酸生成co2，供给rubisco用于碳固定。非光合型有更窄的适宜ph范围，更大的分子量，更高的km值和低的专一性[4]。ku等[13]（1999）等通过农杆菌介导系统，首次成功地将玉米c4光合途径的关键酶pepc的基因导入c3作物水稻中，获得了高表达的转基因植株，特别是转pepc基因水稻株系表现出较高的光合能力。陈绪清（2004）等又成功地将玉米c4型pepc基因在小麦中实现有效表达，这些c4光合基因成功导入c3植物研究，使通过分子育种途径改善c4作物光合作用以提高其光合效率成为可能。ishmaru[14]等将玉米的ppdk基因转入马铃薯中，转基因植株的ppdk活性比对照高5.4倍。表观遗传学通常是指研究在有丝分裂或者减数分裂过程中无法用dna序列改变来解释的基因功能的可遗传性改变[7]。植物表观遗传学是表观遗传学的重要分支，其主要是通过基因表达的调控来影响植物的生理学特性，研究的内容包括dna甲基化，蛋白质共价修饰，非编码rna的调控，染色质重塑，基因组印迹5个方面，其中dna甲基化和组蛋白修饰是基因组表观遗传调控的代表性机制[8]。组蛋白修饰指的是在染色体的组蛋白上发生各种位点特异的翻译后修饰，主要包括核心组蛋白的乙酰化和甲基化（主要是h3和h4），组蛋白的磷酸化，泛素化，adp核糖基化，生物素化，脯氨酸异构化[9]。组蛋白乙酰化比较重要，主要发生于赖氨酸，用来激活基因转录；组蛋白甲基化主要发生于赖氨酸及精氨酸，能够调节染色质结构及细胞生长和增值；组蛋白磷酸化主要发生于丝氨酸，在dna损伤修复及细胞分裂和细胞凋亡中起作用；组蛋白泛素化在赖氨酸上较为常见，主要是引起基因沉默[11]。组蛋白修饰主要是引起染色体结构的改变，如 cantone[12]等发现长期暴露于一定量的砷和镍后会引起组蛋白 h3k9 乙酰化和h3k4 去甲基化的增加，影响染色体的结构，进而影响基因的表达。组蛋白的修饰通常发生在组蛋白的氨基末端结构域上，不同的组蛋白修饰带来的顺式或反式效应会改变核小体的排列。顺式效应是由被修饰的组蛋白尾巴的物理特征的改变引起的，改变核小体间的接触和间距例如静电电荷的调整，组蛋白乙酰化能够中和高碱性组蛋白尾巴的正电荷，使得染色质纤维产生局部扩张，从而使转录机器更容易接近dna双螺旋。磷酸化通过净负电荷的增加形成“电势阱”，从未改变染色质聚合体高级折叠状态来改变核小体包装或暴露组蛋白氨基末端(dou and gorovsky 2000)。反式效应是组蛋白修饰可以通过招募一些结合这些特定修饰的蛋白质到染色质，使其能作用于染色质多聚体。例如，组蛋白尾巴上甲基化的赖氨酸可以与染色质结构域或者其他类似的结构域结合，以促进下游的染色质调节事件(bannister et al.2001;lachner et al.2001)。组蛋白尾部修饰与染色质的结构模式有相关性，一些组蛋白修饰，特别是组蛋白乙酰化通常与允许转录的活性染色质区域相关，另一些修饰，如某些磷酸化修饰的组蛋白残基多与通常不利于转录活性的致密态染色质相关。组蛋白尾部修饰的确立或去除是通过染色质相关酶系统的催化作用完成的，常见的催化蛋白修饰的酶系统及其对应的逆向修饰酶系统通常有四种(vaquero et al.2003;holbert and marmorstein 2005)：组蛋白乙酰化酶及其组蛋白去乙酰化酶（催化组蛋白底物中特定赖氨酸残基的乙酰化，这种乙酰化能够被组蛋白去乙酰化酶所逆转），组蛋白激酶家族和磷酸酶（使特定的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，而磷酸酶可以去除这些磷酸基团标记），两种甲基化酶（催化底物是精氨酸残基的组蛋白精氨酸甲基转移酶和催化赖氨酸残基的组蛋白赖氨酸甲基转移酶）和去甲基化酶（赖氨酸特异性去甲基化酶和双加氧酶）[12]。若干研究组开始推测染色质蛋白（包括组蛋白）的翻译后修饰语基因转录或染色体整体结构相关（allfrey et al.1974; louie et al. 1974; weintraub 1974）。通过对酵母的研究，明确了组蛋白h3和h4的重要性，特别是组蛋白h3和h4的n端尾巴与沉默的异染色质的形成直接相关（thompson et al.1993）。losickfa等发现了组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶。imai等发现sir蛋白是一种组蛋白去乙酰化酶，这是唯一在所有真核生物中都具有明确的同源蛋白并调节pev的sir蛋白。组蛋白h4氨基末端尾巴的净电荷，不管该电荷位于何处，对dna结合或表型都有显著的影响（megee et al.1995;zheng and hayes2003）。转录活跃基因的组蛋白h3一般会被h3.3变体以一种转录偶联的机制置换掉，而不依赖于dna的复制（ahmad and henikoff 2002）。张琦[15]等研究了组蛋白h3的乙酰化（h3k9ac）水平、组蛋白h4的乙酰化（h4k5ac）水平和组蛋白h3的甲基化（h3k4me2，h3k9me，h3k9me2和h3k27me2）水平，以及这些表观修饰在玉米主根的分生区、伸长区和成熟区中的分布模式。整体而言，根部成熟区的细胞表现出组蛋白修饰水平最高，根的分生组织中的组蛋白修饰水平最低。

dna甲基化是指在dna甲基转移酶的作用下，是s腺苷甲硫氨酸的甲基基团转移到胞嘧啶第5位碳原子上的过程[10]中的dna甲基化通常情况下发生在对称的cg、chg（h等于a,t,c），以及不对称的chh背景下，植物中的dna甲基化主要发生在转座子和其他重复序列上，植物中一些物种的基因组比较大，通常转座子比较丰富，例如玉米的转座子占到基因组的80%，其基因组整体表现出高度甲基化[9]。植物dna甲基化主要有两种方式，1种为从头甲基化，指的是均未甲基化的2条链的dna被甲基化；另一种是保留甲基化，即双链dna的1条链已存在甲基化，另1条未甲基化的链被甲基化[10]。主要存在的能实现dna甲基化的甲基转移酶：第一种是met1甲基转移酶，在甲基转移酶中占统治地位，负责维持单拷贝和重复的dna序列甲基化。第二种是结构域重排甲基转移酶（drm），主要包括drm1,drm2和zmet3，主要负责维持转基因沉默位点的胞嘧啶及失活转座子进行甲基化修饰，同时甲基化非对称位点从头甲基化dna序列。第三类是植物所特有的染色质甲基化酶（cmt），负责甲基化cpnpn（n非g）和cpnpn和cpnpg核苷酸序列中的胞嘧啶[8]。

研究意义

2. 研究的基本内容和问题

研究目的

本课题的进行，一方面将探究c4植物中的光合基因在m细胞和bs细胞中的特异性表达水平与表观数据之间的关系，另一方面能加强我们对c4光合途径的理解，揭示生物学研究的模式物种玉米的表观遗传现象与基因特异性表达的关系。

3. 研究的方法与方案

4. 研究创新点

特色之处

从表观遗传学的角度解释光合基因的表达调控机制。

5. 研究计划与进展

进度安排

2018.9-2018.10 玉米幼苗培养（光照16h，黑暗8h室温培养b73 10天）

叶片，维管束鞘细胞和叶肉细胞的收集