环介导等温扩增技术检测水稻种子中稻瘟病菌方法的建立开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，简称lamp）技术是由notomi等^[1]于2000年报道的一种新型的体外恒温扩增特异dna片段的分子生物学技术。该技术是利用链置换dna聚合酶和一套4个特殊设计的引物（包括正向内引物、反向内引物、正向外引物、反向外引物），在恒温的条件下实现对目标序列的扩增，其扩增效率可以达到10⁹-10¹⁰的数量级。在lamp反应的进行中，大量产生的焦磷酸根离子会与镁离子产生一种白色沉淀的副产物焦磷酸镁^[2]，可用肉眼观测沉淀是否产生，或加入金属离子指示剂，通过溶液颜色的变化来判断反应的结果。

与传统的pcr扩增相比，lamp技术具有以下的优点：（1）扩增的效率高，可在30-60min扩增10⁹-10¹⁰的数量级^[3]；（2）扩增的特异性强，需要4个寡聚核苷酸引物识别靶序列上的6个不同的结合区域；（3）快速高效，检测的时间短，仅需60min左右；（4）操作简单，不需要昂贵的热循环仪器，反应可以在恒温条件下（60-65℃）进行；（5）反应可以被两个特异设计的环引物加速；（6）产物检测方便，反应结果不需要用凝胶电泳来评估，可以直接用肉眼观察判断^[4]。

lamp技术因为其特异性强，反应速度快，反应时间短，操作过程简便，结果容易判断等特点，在病原菌的分子检测中有占有一定的优势，且已经应用于病原微生物的检疫检测中。随着该技术体系的不断发展和完善，其在分子检测领域的应用也将越来越来广泛和深入。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

水稻稻瘟病菌lamp体系的建立

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

利用lamp技术实现对稻瘟病菌及带菌种子进行高效特异的检测。

技术路线：

4. 研究创新点

本课题利用LAMP技术对稻瘟病菌及带菌种子进行检测。LAMP技术是一项新型的核酸扩增技术，其特异性强，反应时间短，快速高效、灵敏度高。与之前的利用传统PCR扩增的方法来检测病原菌相比，具有较大的优势。

同时本课题利用HNB进行反应结果的检测，可以直接利用肉眼观察进行判断，呈天蓝色时为阳性，呈紫色则为阴性。由于HNB是在反应前加入，减少了被污染的可能性。如利用SYBR green 进行结果的检测，是在反应结束后开盖加入，大大增加了污染的可能。

5. 研究计划与进展

2018.9-2018.10

lamp技术原理的学习，相关文献的阅读，稻瘟病菌及相关真菌的收集培养和处理。完成对稻瘟病菌靶标序列的确定工作。

2018.11-2019.01