水稻谷蛋白合分选相关基因F968的图位克隆开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1. 本课题意义：

水稻属于颖果，其贮藏性物质主要存在于胚乳中。胚乳从外至内可以划分为3个部分，最外面的1-2层细胞为糊粉层，其中主要贮藏着脂肪类物质，显微观察发现其中存在大量的油体；紧挨着糊粉层的是两层亚糊粉层细胞，贮藏蛋白主要在这两层细胞中以蛋白质贮藏体的形式存在，其中包含少量淀粉粒；亚糊粉层内部为胚乳细胞层，其中分布着大量的淀粉粒及少量的蛋白体。但广义上，亚糊粉层细胞也属于胚乳细胞。水稻中蛋白体有两种类型，一种呈圆形，直径在一个微米左右，称为一型蛋白体（Protein Body I，PBI）[1]，其内部存在年轮状结构，外圈被镶嵌着核糖体的膜状结构包围，超细微结构观察能捕捉到PBI和内质网连接在一起，说明PBI来源于内质网，免疫标记显示其中贮藏着醇溶蛋白。另一种蛋白质贮藏体呈不规则的外型，外径较大，可达3-5微米，称为二型蛋白体（Protein Body II，PBII）。PBII外圈的液泡膜证明了其来源于液泡，其中贮藏着两种蛋白质，球蛋白分布在PBII的外周，中间是由谷蛋白构成的多边形的晶体结构。水稻中谷蛋白和球蛋白可以被人体吸收利用，而醇溶蛋白质因贮藏在致密的PBI中，不能被人体消化吸收。通过提高水稻中谷蛋白的含量可以提升稻米的营养品质，这对新品种培育来说有重要意义。与此同时，大量吸收谷蛋白对某些特定人群如肾脏疾病患者来说会造成病情的恶化，也可以通过降低谷蛋白含量来培育适合特殊人群食用的水稻新品种。本文以近年国内外相关文献作为依据, 综述了水稻籽粒中储藏蛋白的组成，谷蛋白突变体的种类，谷蛋白的合成，加工，分选以及沉积与谷蛋白基因的克隆的研究进展, 旨在为深入研究水稻贮藏蛋白合成途径与其分子机制，为培育适合不同人群需求的谷蛋白功能性专用水稻新品种提供进一步的借鉴和参考。

2. 国内外研究概况

2.1水稻胚乳中储藏蛋白的组成

水稻种子储存着大量的贮藏蛋白，对于种子的萌发以及苗期生长的全过程具有重要的作用。谷物种子中的贮藏蛋白，根据其溶解性的不同，可分为醇溶蛋白（prolamins，可溶解于醇中），谷蛋白（glutelins，可溶解于稀酸稀碱中），清蛋白（albumins，可溶解于水中）和球蛋白（globulins，可溶解于盐溶液中）^[1]。其中谷蛋白占胚乳总蛋白70-80%，而醇溶蛋白占18-20%，这与其他禾谷类作物有着显著的区别，后者的贮藏蛋白主要是醇溶蛋白^[2]。水稻种子蛋白贮存在两类蛋白体中，分别为PB-I和PB-Ⅱ。其中PB-I抗酶解，而PB-Ⅱ易被酶解。通过SDS-PAGE检测到PB-Ⅱ由分子量为22kDa、26 kDa、37 kDa、38kDa、39kDa的多个成分组成；PB-I由分子量为10kDa、13kDa、16kDa、57 kDa多肽组成。再经过溶解度分步分离，确定了22kDa、37kDa、38kDa、39kDa、57kDa大小的多肽是谷蛋白，13kDa为醇溶蛋白，10kDa、16kDa、26 kDa为球蛋白。因此，PB-I和PB-Ⅱ分别为醇溶蛋白储存体和谷蛋白储存体^[3]。

2.2谷蛋白突变体的种类

水稻谷蛋白基因在细胞核内表达之后，通过核孔水稻谷蛋白在粗面内质网上合成谷蛋白前体，之后进入粗面内质网腔，再由高尔基体转运到PB-Ⅱ中，然后该前体被水解成α和β 两个多肽，其中α为酸性亚基，β为碱性亚基，分子量分别为37000～39000和22000～23000^[4] 。谷蛋白突变体大致划分为低谷蛋白、高谷蛋白及57000前体增加 (57H) 3种突变类型^[5]。

2.2.1低谷蛋白突变体

低谷蛋白突变体是指胚乳中谷蛋白含量明显下降的突变体类型。主要有type-1，type-2，type-3和LGC-1。对type-1，type-2，type-3遗传分析表明它们都分别受单隐性基因glu-1，glu-2，glu-3的控制。并且在各突变体与其原始亲本杂交获得的凡F2种子中,谷蛋白亚基突变相关条带的浓淡有无表现出基因剂量效应。Iida等利用化学诱变剂乙烯亚胺处理普通粳稻品种日本优(Nihonmasari)的种子，得到一个低育、半矮、早黄的突变系LGC-1 ^[7]。其各蛋白亚基的相对含量发生了明显变化，谷蛋白含量约50%，而醇溶蛋白却增加了1倍有余。聚丙烯酰胺双向凝胶电泳显示，在4个酸性亚基条带中，α-1表现为缺失，3个碱性亚基条带中最小的一个带β -3 的含量减少[8] 。经临床试验证明:LGC-1可以作为肾脏病人和糖尿病人专用的辅助食品，有效地缓解病人的病情。除了诱变材料之外， 自然界中也存在着一些天然低谷蛋白突变体。江绍玫等[9] 对全国16个省区的地方品种以及数个来自日本和国际水稻研究所的水稻品种共168份核心种质材料进行了种子全蛋白的SDS-PAGE电泳技术分析，筛选到了来自太湖地区编号为W3660 的低谷蛋白种质。

2.2.2 高谷蛋白突变体

谷蛋白含量比正常水稻品种显著增加的突变类型为高谷蛋白突变体。高谷蛋白品种具有较高的营养价值 ^[10]。因此，该类型的突变体可作为营养价值较高的高谷蛋白遗传资源在育种上加以利用。Kumamaru等^[11] 利用MNU处理粳稻品种金南风(Kinmaze)受精卵细胞, 获得2个高谷蛋白突变体CM1834和CM21，其谷蛋白含量都明显高于亲本， 醇溶蛋白的含量显著降低。

2.2.3 57H突变体

到目前为止，一共有11种水稻谷蛋白57H突变体被报道，包括gpa1/glup4, gpa2/glup6, gpa3, gpa4/glup2, gpa5,gpa6,W379/glup3, esp2, glup1/esp5,Glup5, and glup7。

胚乳贮藏蛋白突变体2(ENDOSPERM STORAGE PROTEIN MUTANT2, ESP2)编码一种蛋白质二硫键异构酶(PROTEIN DISULFIDE ISOMERASELIKE protein，PDI)， esp2种子发育不正常，并且经SDS-PAGE检测谷蛋白前体积累量显著增加，电镜观察发现esp2突变体内出现内含谷蛋白前体的新型蛋白体，前体通过二硫键与富半胱氨酸（Cys）的醇溶蛋白聚集在一起。研究表明esp2突变体内PDI发生异常，导致内质网胁迫，从而造成谷蛋白分选途径发生异常。

谷氨酸前体突变体3（GLUP3）编码一种液泡加工酶1（VACUOLAR PROCESSING ENZYME1，VPE1），OsVPE1是拟南芥βVPE的同源基因，核苷酸序列分析发现W379发生一个错义突变，将269位的半胱氨酸（Cys）突变为甘氨酸（Gly）。和野生型相比，虽然突变体W379可以讲蛋白正确分选到液泡中，但是OsVPE1的酶活完全丧失。进一步研究发现，OsVPE1的错误剪切，导致突变体中成熟的蛋白体在外观上显著小于野生型。综上所述，OsVPE1是一种半胱氨酸蛋白酶，它在水稻谷蛋白成熟过程中发挥重要作用。谷蛋白前体的液泡加工需要OsVPE1，且Cys269是关键残基，对维持OsVPE1的酶活性至关重要。

gpa1（glutelin precursor accumulation1）突变体种子胚乳呈现粉质表型，并且伴随着57 kDa谷蛋白前体的显著增加。透射电镜分析发现突变体的胚乳细胞中内质网腔增大，二型蛋白体PBⅡ体积显著减小，并且出现了3种新型的亚细胞结构。进一步研究发现，gpa1中有一部分谷蛋白并没有被分选至蛋白体PBⅡ中，而是被错分配至新型的结构或者分泌物中。图位克隆表明OsRab5a的突变导致了这样的表型。OsRab5a编码一个小G蛋白，因此OsRab5a在蛋白向PBⅡ运输通路中发挥重要作用。

gpa2（glutelin precursor accumulation2）突变体是OsVPS9A功能缺失突变体，OsVPS9A编码RAB5A的一个鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine Nucleotide Exchange Factor, GEF）。gpa2突变体蛋白体以DVs的形式被错误的分选至壁旁体和沿细胞壁的质外体中，从而导致PBⅡ体积的减小。进一步研究发现VPS9A可以与RAB5A互作，因此OsVPS9A和OsRAB5A可能协同工作，并在DV介导的后高尔基谷蛋白前体向PBII（PSV）的运输中发挥调节作用。

gpa3（glutelin precursor accumulation3）突变体种子胚乳粉质不透明且谷蛋白前体量增加。gpa3突变体中，大量的含有谷蛋白前体的致密囊泡DVs被错误分选至质外体空间，并且通过膜融合形成了一个名叫壁旁体的结构。进一步研究发现，GPA3可以直接与VPS9a相互作用，并且与Rab5a及VPS9a形成一个复合体，因此GPA3与Rab5a和VPS9a协同作用于水稻胚乳中贮藏蛋白向PSV的转运。

gpa4（glutelin precursor accumulation4）突变体种子胚乳内57 kDa蛋白前体积累量增加，并且电镜下观察有两种由内质网衍生的不正常结构。GPA4编码一种高度保守的膜蛋白GOT1B，该蛋白与已知参与囊泡运输的酿酒酵母GOT1p同源。研究发现GOT1B与Sar1b在内质网出口（Golgi-associated ER exit sites, ERESs）共定位，通过酵母双杂实验发现水稻中Sec23是GOT1B的互作组分，Sec23是COPⅡ外壳的关键组分,同时Sec23与GOT1B同时存在于水稻的Sar1b蛋白复合体中。因此GOT1B在介导植物细胞中COPⅡ囊泡的形成起着重要的作用，从而影响了分泌蛋白顺势转运过程。

gpa5（glutelin precursor accumulation5）突变体是最新关于谷蛋白前体增加突变体的报道，该突变体在定向DVs到PSVs转运途径存在缺陷，导致货物蛋白被释放到胞外空间。图位克隆发现GPA5编码一种植物特有的含phox同源域的蛋白，该蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)核内体具有PX结构域的RAB效应子同源。GPA5编码同型二聚体的膜相关蛋白，并且它在胚乳中特异性的定位与DVs。进一步研究表明GPA5与Rab5a和VPS9a两个蛋白相互作用，介导DVs向PSVs的运输，因此GPA5扮演着Rab5a植物特有的效应因子的角色，介导水稻胚乳中DV与PSV的系链和膜融合。

gpa6（glutelin precursor accumulation6）突变体胚乳细胞中，谷蛋白前体被错误的分选导致二型蛋白体PBⅡ体积变小，并且在胞质外出现DVs并且出现壁旁体结构。gpa6编码Na / H 反转运蛋白OsNHX5。OsNHX5蛋白定位于高尔基，后高尔基体（trans-Golgi network, TGN）以及前液泡区室（pre-vacuolar compartment，PVC）。体内pH测量表明，gpa6中高尔基体，TGN和PVC的内腔的酸性高于野生型。因此OsNHX5在调控水稻种子贮藏蛋白转运的膜腔内pH方面具有重要作用。

2.3水稻谷蛋白的合成与分选

水稻中的贮藏蛋白从在ER中合成到被运送并沉积到特定的贮藏体中，是一个复杂的细胞生物学过程。贮藏蛋白的mRNA正确的定位到内质网（ER）是贮藏蛋白能够合成和正确的转运、沉积的前提。水稻各贮藏蛋白的mRNA并不是被随机地转运到ER上的，而是被特异性地转运到ER的不同区域^[14]。其中谷蛋白的mRNA被转运到邻近的潴泡型内质网（cisternal ER）中，最终被转运沉积在贮藏型液泡中形成二型蛋白体^[16]。水稻中的谷蛋白首先在内质网中以57kDa前体的形式合成，而后剪切掉信号肽，并接受Bip（lumenal chaperon bin`0oraccumulating compartment like，PAC）直接进入蛋白质储藏液泡中（Protein Storage Vacuoles, PSV）^[15]，或被转运至Golgi体并进一步进行加工修饰，缺省的情况下蛋白将通过反面高尔基体管网结构（Trans-Golgi networks, TGN）形成的致密囊泡（Dense vesicles, DV）被分泌到细胞膜外，但由于谷蛋白带有液泡分选信号（Vacuolar Sorting Signal, VSS），VSS引导DV进入蛋白质储藏液泡，经液泡加工酶的特异剪切形成成熟的酸性和碱性亚基沉积，形成PBII。上述途径任一步骤存在缺陷，都有可能导致谷蛋白不能进入最终目的地PBII，而以谷蛋白57kD前体的形式存在，这类突变体被称为谷蛋白57H突变体，它们是研究谷蛋白合成、转运途径的优良材料^[17]。

2.4谷蛋白基因的克隆

水稻谷蛋白是由多基因家族编码的。在水稻基因组中已经找到15个编码谷蛋白的结构基因，根据其序列相似性，传统的谷蛋白分类根据序列的相似性将其分为A、B两个亚家族，分别命名为GluA-1、gluA-2、gluA-3、gluA-4（假基因）、gluB-1a、gluB-1b、gluB-2、gluB-3（假基因）、gluB-4、gluB-5、gluB-6和gluB7^[18]。亚族间序列的相似性为60-65%，而亚族内序列的相似性达80%-88%。其他各基因都在水稻胚乳发育过程中特异性地表达/翻译。谷蛋白的结构基因均含有四个外显子和三个内含子，编码484-510个氨基酸不等的多肽，大小在57kDa左右。

迄今, 至少有13个不同来源的57H突变体基因被定位在水稻相应的染色体上(表1)。研究还发现上述突变基因间不仅不等位, 相互间还存在着一定的互作关系。如esp-2 突变基因对Glup-1 、glup-2 、Glup-5 、glup-7 具有上位性效应, 而glup-4 对esp-2 、Glup-1 、glup-2 和glup-3 基因具有加性效应。同时，这些错综复杂的关系, 也为进一步研究谷蛋白的调控机理提供了重要的基础材料。

表1 水稻谷蛋白分选突变体

Table1 List of mutants for rice glutelin sorting

2.5水稻其他贮藏蛋白编码基因

得益于水稻全基因组测序的完成和生物信息学的发展， Saito等人在前人研究的基础上，在多个数据库（NCBI、RAPDB和MPSS）中搜索了水稻中醇溶蛋白基因，共在水稻基因组中找到34个编码醇溶蛋白的结构基因（表1-1），可分为三个亚家族，10kDa、13kDa和16kDa。其中，13kDa可以进一步分为13a-1、13a-2、13b-1和13b-2四个亚家族，13a-1和13a-2编码贫硫醇溶蛋白，13b-1和13b-2编码富硫醇溶蛋白。醇溶蛋白基因常具有多个拷贝，其中13b-2具有18个拷贝，10kDa、13a-2和13b-1各含有4个拷贝，13a-1和16kDa各含有2个拷贝(Saito Shigemitsuet al., 2012)。水稻球蛋白是由单一基因编码的，编码产物大小为26kDa单一多肽。水稻醇溶蛋白和球蛋白编码基因均不含有内含子，且在启动子区域存在相似性。

表2 水稻贮藏蛋白结构基因分类(Saito等，2012)

Table2 Classification of rice storage proteingenes

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标：

对此水稻蛋白突变体进行表型的鉴定、显微观察，并进行突变基因的精细定位，为后续的基因克隆奠定基础。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1研究方法

1.1表型鉴定，扫描电镜观察：

在灯箱下观察该突变体的异常表型，取野生型、突变体发育12daf胚乳，采用2.5%戊二醛（0.1m ph7.0）4度固定12h后，送生命科学实验中心进行后续处理，采用power tome xl超薄切片机切片，采用h-7650透射电子显微镜观察；

4. 研究创新点

蛋白分选与转运是个很复杂的过程，它的正常进行直接影响了植物的生长发育等相关性状，而目前国际上从事水稻谷蛋白转运途径研究较少，且进程较慢，但是谷蛋白转运途径是禾本科蛋白转运的模式系统，研究它具有非常重要的意义。而本课题中，通过筛选突变体库，获得了一份新的57H谷蛋白突变体，并初步基因定位在chr2上，可能是研究阐明水稻谷蛋白的转运途径的又一新的重要的材料。

5. 研究计划与进展

研究计划

1）2019年7月-11月：收获f968/r498f2植株上f2：3的种子，收磨米鉴定f2代中极端个体（培养基无菌条件下发苗），进行dna提取和ssr标记凝胶电泳，连锁分析粗定位。

2）2019年12月-2020年7月：基因的精细定位。