1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
基因转录受到基因启动子和基因远端调控元件——增强子之间相互作用的严格控制。尽管对增强子进行了广泛的研究，但我们对增强子的作用机理和时空活动的理解仍然非常有限。更好的理解最终将导致对基因转录控制和植物发育以及环境适应过程中中涉及的调节性遗传变异的作用的基本了解。
1981年，banerji等[1]发现hela细胞中，报告基因与sv40 dna重组体中报告基因转录增强数百倍，第一个增强子被确定为sv40病毒基因组的72 bp序列。此后，在动植物的基因组中也发现了大量的增强子序列，其生化和功能特性也进一步被研究。增强子上有转录因子特异性结合的短基序，这些转录因子同时又会招募共转录因子或共抑制子，以此来决定增强子的活性。此外，增强子的活性也与染色质的结构具有一致性：活性的增强子上没有核小体，即增强子在染色质可及区域——转录因子可以与之结合。但是增强子的研究仍然是极富挑战的，因为增强子一大典型功能性标志是它们发挥作用没有距离和方向上的限制，甚至有的与靶向基因相隔几百个碱基甚至几兆，无法确定其空间位置以及活性状态，这也阻碍了通过对序列的突变来对增强子进行研究。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
找到可能具有增强子功能的dna片段，并且进行植物体内的验证实验，体内验证其功能。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
研究方法：
生物信息学分析手段与分子实验手段相结合
技术路线：
实验方案：通过数据分析得到3条假设为增强子的序列，进行实验验证。一．原始载体验证：1.烟草所用载体：1.1原始载体序列验证：于存于甘油中取菌液，划线，37℃培养过夜；挑单菌落，摇菌；小提质粒，用GUS和LB序列设计引物送测序1.2 原始载体表达验证：载体转化到农杆菌中，通过小摇，大摇，收集菌体，注射进入生长6-8周的本氏烟中，的3-6片叶中，荧光显微镜检测eGFP表达量。
2.原生质体所用载体：
酶切验证： mini35s(SacI,KpnI)，163-GFP(SacI,KpnI)
二．序列片段扩增
1.提取玉米B73基因组DNA（具体方案按照植物基因组DNA提取试剂盒）
2.设计扩增引物，烟草所用载体PKGWFS7.0-mini35s使用gateway方法构建载体，设计引物是加入BP反应所需序列（ggggACAAgTTTgTACAAAAAAgCAggCTTC和ggggACCACTTTgTACAAgAAAgCTgggTT）；原生质体所用载体使用重组方式构建，设计引物是加入酶切位点（GAGCTC和GGTACC）
3.PCR扩增片段：
PCR扩增（三个片段来自于玉米叶片）配置体系
PCR体系（40 μl分3管）
PCR reaction system
| 成分 | 40μl体系 |
| ddH2O | 9 μl |
| 2XUtaq PCRMix F引物 | 10 μl 0.4 μl |
| R引物 | 0.4 μl |
| 模板DNA | 0.2 μl |
PCR反应程序
PCR reaction procedure
| 循环步骤 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 94℃ | 3min |
| 94℃ | 30S | |
|
35个循环 | 57℃（54.7,57.9,60.3） | 30S |
| 72℃ | 3min（一分钟1kb） | |
| 72℃ | 5min | |
| 保温 | 4℃ | ∞ |
三.构建载体
四．原生质体提取与烟草注射
可行性分析：
1．研究基础扎实，材料与方法齐备
前人基于DHS预测增强子，并通过原生质体瞬时表达的方式进行验证，成功得到结果
烟草瞬时表达系统是较为经典且操作方便的验证系统，经过原始载体的验证，证明增强子的表达能够通过GFP荧光而定性的反映。实验所需材料及仪器均可得，不存在任何设备方面的难题。
2． 研究方案清楚、可操作性强
通过构建两套载体，分别在烟草和玉米原生质体中验证预测的增强子序列，构建载体流程清楚，验证方法清晰。
3．利用现代技术开展研究工作
利用测序手段验证扩增片段以及载体序列，避免过程中的序列错误导致实验错误。
4.导师以及师姐的支持与帮助
导师的仔细指导以及师姐尽心尽力的帮助与指点都为实验能够顺利进行提供了基础。
4. 研究创新点
1.ATAC-seq是一种染色质可及性的较为新颖的测序手段，前人有将同为染色质可及性测序的DNase-seq所得的DHS用于增强子预测，我们创新的利用ATAC-seq数据，并且将其与RNA-seq数据结合分析预测增强子。
2.构建两套载体，分别运用于烟草的瞬时表达系统和玉米原生质体瞬时表达系统，可以验证预测的增强子是否具有物种的特异性，即在单子叶与双子叶植物中是否具有差异性。
5. 研究计划与进展
2020/1/19之前将载体构建好，预期能够在年前得到部分结果。
