1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,pcp)又称坏死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae, app)引起的一种猪高度传染性呼吸道疾病。
该菌能引起各个年龄阶段的猪发生急性或慢性的感染，以急性出血性纤维素性胸膜炎和出血性肺炎为主要特征[1]，感染且未死亡猪只呈生长缓慢或无症状带菌状态，成为主要传染源，给养猪业造成巨大的经济损失[2-3]。
由于胸膜肺炎放线杆菌血清型较多，不同地区和猪场流行的血清型不尽相同，我国流行的优势血清型主要是1、2、3和7型。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：（1）得到猪传染性胸膜肺炎apxi、apxⅡ、apxiii及omp2的基因克隆；（2）构建原核表达载体，使猪传染性胸膜肺炎apxi、apxⅡ、apxiii基因在菌体上清中表达溶血外毒素蛋白，omp2在菌体上清中的表达外膜蛋白；（3）对这4种蛋白进行sds-page、western blot鉴定。
研究内容：（1）pcr方法扩增apxi、apxⅡ、apxiii及omp2的基因；（2）将apxi、apxⅡ、apxiii及omp2与转移载体进行连接，筛选出阳性克隆并测序；（3）测序正确的克隆保留菌株，基因片段与表达载体连接，筛选出表达量较高的阳性克隆，提取质粒；（4）将质粒导入表达菌株，对产物进行sds-page鉴定；（5）用western blot的方法对表达产物进行最终鉴定。
拟解决的关键问题：（1）apxi、apxⅡ、apxiii及omp2基因的克隆与重组载体的构建；（2）apxi、apxⅡ、apxiii及omp2相关蛋白的表达；（3）apxi、apxⅡ、apxiii及omp2相关蛋白的鉴定。
3. 研究的方法与方案
研究方法及实验方案：（1）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxi、apxⅡ、apxiii、omp2蛋白基因片段的扩增根据上述基因序列设计特异性引物，pcr扩增目的基因片段。
pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖凝胶块，用dna快速回收纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。
（2）转移载体的构建及鉴定将pcr回收片段进行酶切，apxi连接ptop载体，apxⅡ、apxiii、omp2均连接peasy载体载体，转化感受态细胞dh5α，取阳性克隆扩大培养，提取质粒，进行测序。
4. 研究创新点
（1）高效率的蛋白质表达系统是研究本课题的不可缺少的基本技术，大肠杆菌作为宿主的表达系统中被广泛使用于生产重组蛋白。
然而，对于某些基因，尤其是片段较大的情况下，蛋白表达很困难或者表达的蛋白质不溶。
在实验条件下，当培养的大肠杆菌的温度充分降低，几乎暂时停止生长大部分的蛋白表达减少，此时一组蛋白质称为冷休克蛋白被专门诱导表达。
5. 研究计划与进展
2017年9月1日～2017年9月12日申请课题，查阅资料；2017年9月13日～2017年9月16日 熟悉实验室环境，学习操作技能，做好前期准备工作；2017年9月17日～2017年9月28日 摸索条件，克隆目的基因片段，做好测序鉴定；2017年9月29日～2017年10月30日进行重组转移载体、重组表达载体的构建；2017年11月1日～2017年12月20日对表达出的蛋白产物进行初步鉴定，探索最优表达条件；2018年4月15日～2018年5月15日 对表达出的目的蛋白进行最终鉴定，对实验结果进行总结并撰写毕业论文。
