1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
大豆花叶病毒( soybean mosaic virus，smv) 病是一种分布广泛、危害严重的世界性大豆病害，植株受侵染后出现花叶，影响光合作用，致使产量下降；籽粒出现褐斑，影响大豆的外观品质和商品价值，是目前我国东北、黄淮海、长江流域和南方大豆产区最重要的大豆病害之一。
smv属马铃薯y病毒科(potyviridae)y病毒属(potyvirus)，大豆花叶病毒种。
病毒在体外不稳定，常温时，能存活3到4天，一般温度越低存活时间越长，钝化温度60～70℃，稀释限点100～1000倍，体外保毒期1～4天。
2. 研究的基本内容和问题
1. 研究目标：以大豆中的eif4e和eif(iso)4e基因为目标基因，构建 crispr/cas9敲除载体，以期为后续利用crispr/cas9体系敲除大豆eif4e和eif(iso)4e基因提供研究基础，为大豆抗花叶病毒的研究和育种进程提供帮助。
2. 研究内容：2.1 根据大豆的eif4e和eif(iso)4e基因序列设计sgrna；2.2 构建crispr/cas9敲除载体，并检测打靶效率。
3. 拟解决的关键问题：eif4e和eif(iso)4e基因的crispr/cas9载体构建。
3. 研究的方法与方案
1. sgrna的设计：1.1 从数据库 phytozome（www.phytozome.net/）下载大豆eif4e和eif(iso)4e的基因序列及相关信息；1.2 利用网页工具crispr-p（http//cbi.hzau.edu.cn/crispr/）自动生成sgrna靶标序列，靶位点设计原则如下：①靶位点主要是位于ngg（前间区邻近基序，pam）三个碱基的前20个碱基；②靶位点一般位于编码区的前段。
2. crispr/cas9载体的构建：将设计的不同的sgrna分别连接到crispr/cas9载体上。
3. 质粒载体转化大肠杆菌：利用热激法将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，并筛选阳性克隆。
4. 研究创新点
1. CRISPR/Cas9技术是新一代的基因编辑技术，能对特定基因位点进行切割导致突变，具有效率高、速度快、操作便捷及简单经济的特点，将该技术应用于大豆SMV抗性的研究中，是一项创新之处；2. 利用CRISPR/Cas9技术敲除大豆eIF4E和eIF(iso)4E基因，得到的转基因植株具有广谱抗性，非小种专化型抗性，比起小种专化想抗性在生产上有更广泛的应用，且eIF4E及其同源基因eIF(iso)4E已经被鉴定为抗马铃薯Y病毒的隐性基因，病毒需要的宿主因子缺失引起的隐性抗性可能会比显性R基因更持久，因为这种抗性对病毒的选择压力更低，其进化出相应防卫策略所需要的时间也就更久；3. 基于大豆是古四倍体，本实验所构建的CRISPR/Cas9载体是多元敲除载体，能有效敲除eIF4E或eIF(iso)4E同源基因功能互补的影响，从而显著提高大豆的SMV抗性。
5. 研究计划与进展
2018年3月：设计sgRNA，构建CRISPR/Cas9载体；2018年4月：检测载体打靶效率；2018年5月：整理分析实验数据，撰写开题报告，准备中期考核，撰写毕业论文。
