水稻谷蛋白57H突变体Y236的遗传分析与基因定位开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1. 本课题意义：

水稻（Oryza sativa L.）是禾本科作物的模式物种，是重要的农业作物，其植物种子储存着大量的贮藏蛋白，它是稻米中仅次于淀粉的第二大贮藏物质，对于种子的萌发以及苗期生长的全过程具有重要的作用。谷物种子中的贮藏蛋白，根据其溶解性的不同，可分为醇溶蛋白（prolamins，可溶解于醇中），谷蛋白（glutelins，可溶解于稀酸稀碱中），清蛋白（albumins，可溶解于水中）和球蛋白（globulins，可溶解于盐溶液中）。在大多数谷物中，贮藏蛋白主要以醇溶蛋白的形式存在。而在水稻中，谷蛋白的含量最高，占种子中总蛋白的70%以上，对稻米外观品质，食味品质等具有重要影响。

水稻谷蛋白57kDa前体增加突变体是谷蛋白前体发生错误分选而未能进入蛋白质贮藏液泡或进入液泡后不能正常剪切所形成的一类特殊的突变体，它们为研究谷蛋白的分选提供了优良的材料，同时，水稻谷蛋白的分选已经成为植物中尤其是单子叶植物（禾本科）蛋白质分选的模式系统。因此，在本课题中，我们将致力于对谷蛋白前体增加突变体的筛选，通过对这些突变体材料的研究，将克隆和鉴定一系列谷蛋白在生物合成途径、翻译后修饰、转运及积累过程中的关键基因，为逐步阐明这些关键基因的分子作用机理，形成一个清晰的谷蛋白从合成至积累的网络途径具有重要意义。

2. 国内外研究概况

2.1水稻种子贮藏蛋白的组成

高等植物种子中往往积累大量的储藏蛋白（Seed storage protein, SSP），作为种子萌发、幼苗生长的碳、氮、硫等营养来源。水稻种子中含有8%-10%的贮藏蛋白，根据其溶解性的不同，可分为醇溶蛋白（prolamins，可溶解于醇中），谷蛋白（glutelins，可溶解于稀酸稀碱中），清蛋白（albumins，可溶解于水中）和球蛋白（globulins，可溶解于盐溶液中（OsBorne, 1924）。水稻中谷蛋白占总贮藏蛋白的60-75%，醇溶蛋白占20-25%，此外还含有少量的清、球蛋白（Ogawa et al., 1987; Li et al., 1993）。这与其他禾谷类作物（如小麦、玉米等）有着显著的区别，后者的贮藏蛋白主要是醇溶蛋白。同时，由于谷蛋白易于被人体消化吸收，属于优质蛋白，因此谷蛋白是水稻蛋白品质改良的首要目标。

在水稻中，谷蛋白主要以37-39kDa酸性亚基和22-23 kDa碱性亚基两种形式存在，此外还含有少量57kDa前体。这一类蛋白质首先在胚乳细胞中的内质网上以57kDa前体的形式合成，经过复杂的囊泡运输过程，转运到蛋白质贮藏液泡中。在那里谷蛋白前体在液泡加工酶的作用下水解成为40kDa酸性亚基和20kDa碱性亚基，最终聚集形成二型蛋白质贮藏体。水稻醇溶蛋白按照分子量不同可分为10kDa、13kDa和

16kDa，而13kDa又可分为a和b两类（Yamagata et al., 1982b）。水稻胚乳中球蛋白占胚乳总蛋白的2-8%，含有26kDa和16kDa两种组分。清蛋白占胚乳总蛋白的5%左右，大小为16kDa。左右，大小为16kDa。

2.2水稻贮藏蛋白编码基因的研究

2.2.1 水稻谷蛋白编码基因

水稻中的谷蛋白是由多基因家族编码的。在水稻基因组中已经找到15个编码谷蛋白的结构基因，根据其序列相似性，传统的谷蛋白分类根据序列的相似性将其分为A、B两个亚家族，分别命名为GluA-1、GluA-2、GluA-3、GluA-4（假基因）、GluB-1a、GluB-1b、GluB-2、GluB-3（假基因）、GluB-4、GluB-5、GluB-6和GluB7（Takaiwa et al., 1986, 1987, 1989, 1991a, 1991b; Higuchi et al., 1987; Okita et al., 1989; Masumura. et al., 1989; Oono, 1991; Kusaba et al, 2003; Niu et al., 2007a, 2007b）；亚族间序列的相似性为60-65%，而亚族内序列的相似性达80%-88%。随着水稻基因组测序计划的完成，人们又相继发现了3个谷蛋白基因，分别属于两个新的亚家族GluC和GluD（表1-1-1）（Mitsukawa et al., 1998; Kawakatsu et al., 2009）。其他各基因都在水稻胚乳发育过程中特异性地表达/翻译。谷蛋白的结构基因均含有四个外显子和三个内含子，编码484-510个氨基酸不等的多肽，大小在57kDa左右(表1-1)。

表1-1 水稻贮藏蛋白结构基因分类(Saito等，2012)

Table 1-1 Classification of rice storage protein genes

2.2.2 水稻其他贮藏蛋白编码基因

得益于水稻全基因组测序的完成和生物信息学的发展， Saito等人在前人研究的基础上，在多个数据库（NCBI、RAPDB和MPSS）中搜索了水稻中醇溶蛋白基因，共在水稻基因组中找到34个编码醇溶蛋白的结构基因（表1-1），可分为三个亚家族，10kDa、13kDa和16kDa。其中，13kDa可以进一步分为13a-1、13a-2、13b-1和13b-2四个亚家族，13a-1和13a-2编码贫硫醇溶蛋白，13b-1和13b-2编码富硫醇溶蛋白。醇溶蛋白基因常具有多个拷贝，其中13b-2具有18个拷贝，10kDa、13a-2和13b-1各含有4个拷贝，13a-1和16kDa各含有2个拷贝(Saito Shigemitsu et al., 2012)。水稻球蛋白是由单一基因编码的，编码产物大小为26kDa单一多肽。水稻醇溶蛋白和球蛋白编码基因均不含有内含子，且在启动子区域存在相似性。

1.3 水稻谷蛋白的合成与分选

部分，最外面的1-2层细胞为糊粉层，其中主要贮藏着脂肪类物质，显微观察发现其中存在大量的油体；紧挨着糊粉层的是两层亚糊粉层细胞，贮藏蛋白主要在这两层细胞中以蛋白质贮藏体的形式存在，其中包含少量淀粉粒；亚糊粉层内部为胚乳细胞层，其中分布着大量的淀粉粒及少量的蛋白体。但广义上，亚糊粉层细胞也属于胚乳细胞。水稻中蛋白体有两种类型，一种呈圆形，直径在一个微米左右，称为一型蛋白体（Protein Body I，PBI），其内部存在年轮状结构，外圈被镶嵌着核糖体的膜状结构包围，超细微结构观察能捕捉到PBI和内质网连接在一起，说明PBI来源于内质网，免疫标记显示其中贮藏着醇溶蛋白。另一种蛋白质贮藏体呈不规则的外型，外径较大，可达3-5微米，称为二型蛋白体（Protein Body II，PBII）。PBII外圈的液泡膜证明了其来源于液泡，其中贮藏着两种蛋白质，球蛋白分布在PBII的外周，中间是由谷蛋白构成的多边形的晶体结构。水稻中谷蛋白和球蛋白可以被人体吸收利用，而醇溶蛋白质因贮藏在致密的PBI中，不能被人体消化吸收。

水稻中的贮藏蛋白从在ER中合成到被运送并沉积到特定的贮藏体中，是一个复杂的细胞生物学过程。贮藏蛋白的mRNA正确的定位到内质网（ER）是贮藏蛋白能够合成和正确的转运、沉积的前提。水稻各贮藏蛋白的mRNA并不是被随机地转运到ER上的，而是被特异性地转运到ER的不同区域（Li et al., 1993, Choi et al., 2000）。其中谷蛋白的mRNA被转运到邻近的潴泡型内质网（cisternal ER）中，最终被转运沉积在贮藏型液泡中形成二型蛋白体（Krishnan et al., 1986）。水稻中的谷蛋白首先在内质网中以57kDa前体的形式合成，而后剪切掉信号肽，并接受Bip（lumenal chaperon binding protein）、PDI（protein disulfied isomerase）等分子伴侣的辅助折叠形成正确的构象后，谷蛋白通过由内质网衍生而成的类前体蛋白积累区室（precursor accumulating compartment like，PAC）直接进入蛋白质储藏液泡中（Protein Storage Vacuoles, PSV）（Takahashi et al., 2005），或被转运至Golgi体并进一步进行加工修饰，缺省的情况下蛋白将通过反面高尔基体管网结构（Trans-Golgi networks, TGN）形成的致密囊泡（Dense vesicles, DV）被分泌到细胞膜外，但由于谷蛋白带有液泡分选信号（Vacuolar Sorting Signal, VSS），VSS引导DV进入蛋白质储藏液泡，经液泡加工酶的特异剪切形成成熟的酸性和碱性亚基沉积，形成PBII。上述途径任一步骤存在缺陷，都有可能导致谷蛋白不能进入最终目的地PBII，而以谷蛋白57kD前体的形式存在，这类突变体被称为谷蛋白57H突变体，它们是研究谷蛋白合成、转运途径的优良材料。

1.3 谷蛋白57H突变体的研究进展

水稻谷蛋白和其他高等植物中的球蛋白一样，在转运进入PSV之后，会被液泡加工酶剪切成成熟的形式，该过程只在PSV中发生。如果转运过程发生了错误，将会表

介绍第3种类型即57H突变体的研究进展。水稻中已经报道的57H突变体至少有9个，分别为esp2, Glup1 (esp5), glup2(esp6), glup3(esp7), glup4(esp8), Glup5, glup6, glup7, and Osvpe1(Kumamaru et al., 1987; Satoh et al., 1994, 1995, 1999; Tian et al., 2001, Ueda and Osvpe1(Kumamaru et al., 1987; Satoh et al., 1994, 1995, 1999; Tian et al., 2001, Ueda et al., 2004a, 2004b; Wang et al., 2009)。

esp2突变体表现为谷蛋白前体大量积累，并伴随种子发育异常，图位克隆显示esp2中蛋白质二硫键异构酶（PDI）发生了变异。esp2内质网中由于缺少了PDI，引起了严重的内质网胁迫，BIP表达量大幅上调，但是依然造成了严重的前体增加，说明PDI和BIP具有不同的分子伴侣功能（Sato-Cruz et al., 2010; Han et al., 2012）。因此，OsPDI和OsERO1介导了醇溶蛋白分子间及分子内的二硫键的正确形成，并可将内质网中的谷蛋白前体与醇溶蛋白分开（Onda et al., 2009）。

第二个被细致研究的谷蛋白前体增加突变体是vpe1/glup3。该突变体中定位在PSV中的液泡加工酶发生了突变，该酶位于谷蛋白合成积累途径的最下游，但却发挥着决定性的作用。通过相关研究发现VPE1水解能够影响贮藏蛋白在PBII中的储存，决定了贮藏蛋白能否被高效利用（Wang et al., 2009; Kumamaru et al., 2010）。

osrab5a/gpa1/glup4突变体中，小G蛋白RAB5a发生了突变。该突变体中，部分谷蛋白没有被正确运送到PSV中，导致PBII变小，谷蛋白被错误地运送到细胞外空间，以高电子密度的囊泡状结构存在，并且形成了大量的壁旁体。免疫学实验表明壁旁体中含有本应位于高尔基体、PVC的蛋白甚至内质网中的蛋白，此外还包含大量的细胞壁类物质。免疫胶体金实验显示，RAB5a定位于DV和PSV中，因此，该基因在谷蛋白从高尔基体向PSV的转运过程中发挥了重要的作用（Wang et al., 2010; Fukuda et al., 2011）。

表1-2 水稻谷蛋白分选突变体

Table 1-2 List of mutants for rice glutelin sorting

参考文献

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3. Krishnan HB, Franceschi VR, Okita TW (1986) Immunochemical studies on the role of the Golgi complex in protein-body formation in rice seeds. Planta 169: 471-480.

4. Ogawa M., Kumamaru T., Satoh H., Iwata N., Takeshi Omura, Zenzaburo Kasai, Kunisuke Tanaka (1987). Purification of Protein Body-I of Rice Seed and Its Polypeptide Composition. Plant and Cell Physiology 28(8): 1517-1527.

5. Saito Y., Kishida K., Takata K., Takahashi H., Shimada T., Tanaka K., Morita S., Satoh S., Masumura T. (2009). A green fluorescent protein fused to rice prolamin forms protein body-like structures in transgenic rice. J Exp Bot 60(2):615627.

6. Saito Y., Shigemitsu T., Yamasaki R., Sasou A., Goto F., Kishida K., Kuroda M., Tanaka K., Morita S., Satoh S., Masumura T. (2012). Formation mechanism of the internal structure of type I protein bodies in rice endosperm: relationship between the localization of prolamin species and the expression of individual genes. Plant Journal 70(6): 1043-1055.

7. Satoh-Cruz M., Crofts A.J., Takemoto-Kuno Y., Sugino A., Washida H., Crofts N., Okita T.W., Ogawa M., Satoh H., and Kumamaru T. (2010). Protein Disulfide Isomerase Like 1-1 Participates in the Maturation of Proglutelin Within the Endoplasmic Reticulum in Rice Endosperm. Plant and Cell Physiology 51, 1581-1593.

8. Xiaohua Han, Yihua Wang, Xi Liu, Lin Jiang, Yulong Reng, Feng Liu, Cheng Peng, Jingjing Li, Ximing Jin, Fuqing Wu, Jiuling Wang, Xiuping Guo, Xin Zhang, Zhijun Cheng and Jianmin Wan. The failure to express a protein disulfide isomerase-like protein results in a floury endosperm and an endoplasmic reticulum stress response in rice. Journal of Experimental Botany, 2012, 63: 121-130.

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标：

对此水稻蛋白突变体进行表型的鉴定、显微观察，并进行突变基因的精细定位，为后续的基因克隆奠定基础。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1研究方法

1.1表型鉴定，扫描电镜观察：

在灯箱下观察该突变体的异常表型，取野生型、突变体发育12daf胚乳，采用2.5%戊二醛（0.1m ph7.0）4度固定12h后，送生命科学实验中心进行后续处理，采用power tome xl超薄切片机切片，采用h-7650透射电子显微镜观察；

4. 研究创新点

蛋白分选与转运是个很复杂的过程，它的正常进行直接影响了植物的生长发育等相关性状，而目前国际上从事水稻谷蛋白转运途径研究较少，且进程较慢，但是谷蛋白转运途径是禾本科蛋白转运的模式系统，研究它具有非常重要的意义。而本课题中，通过筛选突变体库，获得了一份新的57H谷蛋白突变体，并初步基因定位在Chr5上，目前没有相关基因的报道，是研究阐明水稻谷蛋白的转运途径的又一新的重要的材料。

5. 研究计划与进展

1 研究计划

1）2016年9月-12月：收获y236/dular f1植株上f2的种子，收获单株种子（f2代）磨米鉴定f2代中极端个体（培养基无菌条件下发苗），进行dna提取和ssr标记凝胶电泳，连锁分析初定位。

2）2017年2月-2017年5月：基因的精细定位。