1. 研究目的与意义
| 背景：纤维素是植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生资源. 据报道，全球每年通过光合作用可以获得新的纤维素约 410 ×1010t，约占地球生物资源总量的 40 % , 相当于每人每天 1814 kg , 其蕴含的能量相当于当今全球总能耗的十倍以上。目前，利用纤维素酶水解纤维素是一种高效且无污染的理想途径，它可以使大量纤维素资源和城市纤维素废料转变成人类所需的物质。利用纤维素酶水解纤维素获得能量，对于提高人民生活水平，缓解能源危机，食物短缺，环境污染等日益严重的社会问题，具有非常重要的意义。固定化酶是二十世纪发展起来的一项新技术，1916年 Nelson 和 Griffin 最先发现了酶的固定化现象后，科学家们就开始了固定化酶的研究工作，1969 年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基水解酶用来从混合氨基酸中生产L - 氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。固定化酶与游离酶相比，具有不可比拟的优点，主要表现在 ：首先，酶与产物易于分开，因而可以回收再利用 ；其次 , 在一定程度上以改善酶的操作性能和稳定性 ; 第三 , 可以多次反复使用和连续操作 , 降低生产成本 ; 第四 , 酶不混入产物 , 可以精简分离工序等[。 固定化酶的制备方法分为载体结合法、包埋法、交联法 3 种。 随着固定化酶技术的发展 , 越来越多的研究者致力于对纤维素酶固定化的研究 , 但是应用交联法固定化纤维素酶的报道很少. 本文采用壳聚糖交联法固定化纤维素酶 , 研究戊二醛浓度和给酶量对固定化酶活性的影响 , 以及固定化酶的最适温度、p H 值、Km. 结果表明 , 交联法得到的固定化纤维素酶与游离酶相比具有很多优点 ,对运用于工业生产具有重要意义。 自Swatloski等发现[BMIM]Cl可以在微波加热下溶解多达25%的纤维素开始，许多离子液体（IL）就被用于纤维素预处理。相比其他的预处理方法，IL能有效增强纤维素的可降解性，并实现高葡萄糖得率。而且IL热稳定性好、不挥发，即便在温和条件下也能溶解许多类型的高分子化合物 。但绝大多数的IL会抑制纤维素酶活性。为避免这一问题，就需要对预处理后的纤维素进行充分的洗涤以去除IL。这样做既不经济又耗费时间。本项目拟采用MOF材料对纤维素酶进行修饰，探索修饰的纤维素酶在离子液体中的稳定性。主要研究内容如下： 1. ZIF-8固定化纤维素酶的吸附量分析；
2. 分析固定化纤维素酶在几种离子液体系中的稳定性规律。
目的：具体针对ZIF-8固定化纤维素酶，及修饰后纤维素酶在离子液体中的活性变化规律开展研究。
意义：ZIF-8修饰的纤维素酶在不同离子液体系中的活性变化规律研究。
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2. 研究内容和预期目标
纤维素酶的固定化可以高效利用纤维素酶并且对提高纤维素酶的活性及在离子液体中的稳定性有明显作用，mof材料zif-8具有永久性的孔隙、高表面积、疏水性、开放的金属位点、良好的水稳定性，这种mof材料目前已有用于固定生物大分子的研究。本研究立足于国内外研究现状，以沸石咪唑类骨架材料zif-8为固定化纤维素酶的载体，旨在探究zif-8固定纤维素酶在离子液体中稳定性、活性、重复利用性。
具体研究内容如下：
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mof材料zif-8的活化（实验中采用甲醇置换活化载体材料）。
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1. ZIF-8甲醇浸泡，超声震荡5min,重复三次操作，冷冻干燥12个小时。
2.纤维素酶的固定化
5ml缓冲液体系，每个离心管加50mg MOF材料，40mg酶，5ul的25%的戊二醛
（1）MIL 酶(0.0415g)
（2）ZIF 酶(0.0403g)
（3）PCN 酶(0.0407g)
(4)只加酶(0.0403g)
3.蛋白标准曲线
标准曲线：y=0.0253x 0.6004 R2=0.9941
4.酶的吸附量
离心后，取上清液，一定比例加G250染色液，96孔板测蛋白含量，固定前与固定后蛋白量相减就是纤维素酶的固定量。
5.固定化酶酶活测定
葡萄糖含量标曲：y=2.5164x-0.069 R2=0.9993，Y(吸光度），x(葡萄糖浓度，mg/ml)
6. 离子液体体系中固定化酶酶活
柠檬酸缓冲液（pH=4.8)
酶促反应：一定浓度的固定化酶0.5ml(0.01g,，50mg滤纸，再加入1ml柠檬酸缓冲液，40℃水浴锅中水浴1h
DNS法测酶活：取1ml反应后的液体置于离心管中，加入3mlDNS试剂，沸水浴5min，在540n、吸光光度下测量吸光值。
对照组：0.5ml一定浓度的游离酶（酶量由MOF质量*吸附率算出）
先用一种离子液体[EMIM]DEP,设置浓度梯度5%-25%,产糖量（mg/ml）
7.固定化酶水解预处理后的甘蔗渣
8.固定化纤维素酶的酶活及动力学参数测定
根据Link webver-Burk图计算Km和Vmax
4. 参考文献
[1]hu dx,ju x, li lz, hu cy, yan ls, wu ty, fu jl, qing m (2016) improved in situsaccharification of cellulose pretreated by dimethyl sulfoxide/ionic liquidusing cellulase from a newly isolated paenibacillus sp. llz1. bioresourcetechnology 201:8-14
[2]cui jd, li ll, zhao ym (2014) simpletechnique for preparing stable and recyclable cross-linked enzyme aggregateswith crude-pored microspherical silica core. industrial engineeringchemistry research 53(42):16176-16182
[3]fei jj, li q, feng yy, ji gs, gu xd (2013)in situ saccharification of cellulose in mild ionic liquid using sodiumalginate immobilized cellulase. applied mechanics materials361-363:339-342.
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1）2022-2-20～2022-03-8：查阅资料撰写开题报告；
2）2022-03-8～2022-03-12：用甲醇置换法活化zif-8材料；
3）2022-03-13～2022-04-1：酶的固定化，载体材料的酶吸附量的测定。
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