1. 研究目的与意义
油菜是我国主要的油料作物之一，因其产油效率高，菜籽油成为我国国产食用植物油的重要来源。2007－2016年，我国油菜种植面积逐年增加，尤其近三年均超过753万hm2。近10年来，油菜病虫害总体处于重发态势，对油菜产量和油料产业安全形成了严重威胁，其中影响较大的10种常发性病虫害中，油菜菌核病位居第一[1]。
油菜菌核病是由核盘菌( sclerotiniasclerotiorum) 侵染引起的一种世界性真菌病害，位居油菜三大病害之首[2]。该病在我国各个油菜产区都有发生，在长江流域发生尤为严重，发病率一般在15%~35% 之间，重病年份损失可达80%以上，种子含油量平均降低5%以上，给农业生产造成巨大的经济损失[3, 4]。目前防治菌核病的主要措施是施用化学农药、培育优良的抗病品种等。但是长期使用化学农药，既容易发生农药残留量高的问题，也容易造成环境和食品污染，同时引发植物病原菌的的抗药性。培育优良的抗病品种是防治油菜菌核病既经济、有效又安全的措施[5-7]，但是因为选育周期时间长、难度大等问题，目前研究进展较慢[2]。植物是牛物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢产物超过40万种，从植物中寻找具有杀菌活性的物质是当前国内外新型杀菌剂创制的一条重要途径。而且植物源农药具有低毒、无残留、选择性高，不易使害虫、病菌产生抗药性的特点，是一种与环境有良好相容性的新型环保农药。因此，国内外研究人员把防治重点逐步转向生物防治。从天然植物中提取天然抑菌防腐物质，提取条件和工艺皆可控制，且天然植物来源十分丰富，筛选具有抑菌活性的中草药或植物提取物，并应用于果蔬防腐保鲜已成为当今研究的热点[8-15]。
茶粕，也叫茶麸、茶籽饼，是油茶籽经榨油后的渣饼，年均产量约为39.71万吨，含有糖、蛋白质、脂质、纤维、茶皂素等多种成分。油茶粕含有大量可再利用的物质，但目前大多数直接用作清塘剂，燃料，肥料，以及日化，农药的加工中，还有少量用于提取茶皂素，由此足以见得油茶粕并没有得到合理的有效利用。。目前，对从油茶粕中提取的茶皂素的抑菌研究较多。黄卫文等[16]以茶皂素为材料对大肠杆菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌等进行了抑菌试验，结果表明茶皂素对细菌具有良好的抑菌效果。我们对油茶粕的研究还有待进一步深入。
2. 研究内容和预期目标
不同浓度油茶粕提取物对油菜菌核病菌细胞生长及形态的影响
不同浓度油茶粕提取物对油菜菌核病菌的生理生化指标的影响
3. 研究的方法与步骤
1 实验材料
1.1 油茶粕：江西地道油茶下脚料油茶粕
油茶粕提取物的制备：称取事先打去脂的油茶粕粉末10 g左右，放于250 mL磨口圆底烧瓶中，加入150 mL乙醇，80 ℃左右回流3~4 h。经8层纱布过滤后，收集滤液。将滤液于40℃条件下旋转蒸发，得到约15mL浓缩液，将浓缩液倒入培养皿中，保鲜膜密封后置于-80 ℃冰箱冷冻过夜。第二天将冷冻后的滤液取出，在保鲜膜上戳洞透气，迅速放于冷冻干燥机中处理48 h，得乙醇提取物。
1.2药品与试剂：
蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、水、葡萄糖、PBS缓冲液、考马斯亮蓝（G-250）
马铃薯、琼脂、无水乙醇等
1.3供试菌种和培养基：
油菜菌核病病菌和马铃薯葡萄糖琼脂培养基
培养基的配制：马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA培养基）：马铃薯200g，蔗糖20 g，琼脂 20 g，蒸馏水1000 mL。
PS液体培养基：（马铃薯液体培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖20g，水1000 mL
菌种的活化：将油菜菌核病病菌接种于马铃薯蔗糖琼脂固体培养基上，于28℃恒温培养4~6天。
2 实验方法
2.1不同浓度油茶粕提取物对油菜菌核病病菌生长的抑制作用
2.1.1抑制菌丝生长速率法：
配制不同浓度的油茶粕提取物母液，将不同浓度母液加入到已融化并冷却到50℃的PSA培养基中，其中培养基与提取液体积比为8：2，充分摇匀，使提取物最终浓度分别为20、10、5、2．5和1．25 mg／mL， 然后分别倒人直径为9 cm的培养皿中制备成带药平板。以不加药剂的PSA平板为空白对照。用打孔器打取菌落边缘生长旺盛的菌圆片(直径9 mm) ，各挑取一块移入对应平板中间，每处理3个重复。置28 ℃恒温箱中培养5 d，观察、测量各处理的菌落直径并摄影，计算菌落平均直径和平均抑菌率。
2.2提取物处理对菌丝形态的影响：
接种油菜菌核病菌菌丝块于Ps液体培养基中，25℃振荡(120 r／min)培养12 h。配制不同浓度的油茶粕提取液，加入到培养有油菜菌核病菌菌丝 的PS液体培养基中。依据前期实验，为了使混合后培养液不过于粘稠，又不会影响菌丝体的营养需求，培养基与提取液体积比采用8：2，混合后充分摇匀，使菌丝均匀地分布于其中，并使提取物最终浓度分别为20、10、5、2．5和1．25 mg／mL。设清水处理为对照。培养24 h后，挑取不同处理下的菌丝，显微镜观察其形态变化。
2.3提取物处理菌丝后电导率测定：
接种油菜菌核病菌菌丝块于PS液体培养基中，25℃振荡(120 r／min)培养4 d，然后将培养液8 500 r／min离心 10 min，抽滤取出菌丝。配制20、10、5、2．5和1．25 m／mL系列浓度的油茶粕提取物，然后分别取不同浓度提取物母液5 mL浸渍处理菌丝(每处理约 3 g菌丝)，摇匀，使提取液能充盈到整个菌丝团中。每个处理设置3个重复。设清水处理为对照。 分别在2、3 h时用电导率仪测定处理后油茶粕提取物与菌丝混合系统的电导率。
2.4提取物对菌核形成的抑制率：
配制20、10、5、2.5和1.25 mg／mL系列浓度的油茶粕提取物，用灭菌后的滴管分别吸取各浓度的提取物，滴加到培养基的菌落(直径4．5 cm)表面，摇匀，使提取物浸湿到整个菌落，每皿滴加2ml提取物。为了有利于菌核的形成，将菌落周围的空白培养基移去。每 个处理设置3个重复。设清水处理为对照。25℃ 培养10 d，挑出菌落上所有菌核，50℃烘箱中烘 48 h后称重，计算提取物对菌核形成的抑制率。
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2.5菌丝胞外生理生化成分的测定：
菌丝的处理：取2 mL培养3 d的真菌菌悬液，等量无菌水为对照，分别在处理后一定时间段内取样，离心制得上清液，待用。
2.5.1胞外可溶性蛋白含量测定：
采用考马斯亮兰G-250染色法。取洁净试管，加入菌丝处理上清液100 L，用蒸馏水定容至1 mL，再加入5 mL考马斯亮兰G-250溶液，静置5 min，于波长595 nm下测OD值。同时以0~100 g/mL牛血清蛋白溶液代替菌丝处理液制得标准曲线，再根据OD值换算菌丝处理液中蛋白的含量（g）。
2.5.2胞外可溶性糖含量测定：
采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法，像洁净的离心管中加入各处理菌丝的上清液200 L，加入400 L DNS，沸水浴5 min。取出立即放入冷水浴中，冷至室温，蒸馏水定容至2.5 mL，混匀于波长540 nm下测OD值。同时制作0~2000 g/mL葡萄糖标准曲线，再根据OD值换算葡萄糖含量（g）。
2.5.3几丁质酶活性测定：
向洁净的试管中加入各处理菌丝的上清液0.6 mL(对照组先煮沸5 min灭活，冷却)，加入胶状几丁质0.6 mL，37℃保温1 h，煮沸5 min灭活，5000 r/min离心10 min，取上清液0.6 mL，加0.8 mol/L硼酸钾溶液0.3 mL，沸水浴3 min，冷却，加1％的DMAB 2.5 mL，36 ℃保温20 min，冷却，于波长544 nm处测定OD值。以反应前后单位时间内OD值之差表示几丁质酶活性。
2.5.4不同浓度油茶粕对真菌CAT、POD酶的影响：
在250 mL锥形瓶内加入80 mL液体培养基PS和8.89 mL不同浓度的油茶粕母液，配成20、10、5、2.5和1.25 mg／mL系列浓度的油茶粕PS液体培养基对照CK( 80 mL液体培养基加8.89 mL无菌水)。用灭好菌的打孔器在生长旺盛的菌落边缘以同心圆方式打菌圆片(直径9 mm) ，取1片菌圆片放入不同处理的PS液体培养基内，25 ℃ 130 r/min恒摇床培养7 d。每处理3个重复。
2.5.4.1过氧化物酶(POD)活性的测定
过氧化物酶（POD）活性的测定选用可见光吸收法：每浓度各2 mL培养液加4 mL样品提取液冰镇研磨成匀浆， 4000 r/min离心 15 min后取1 mL上清液，加3 mL反应液于常温25 ℃反应5 min后马上于470 nm处测可见吸光值。对照( CK)中加入3 mL反应液、 1 mL PBS ( pH 6.0)。每处理3个重复。
2.5.4.2氧化氢酶(CAT)活性的测定
氧化氢酶(CAT)活性的测定选用紫外吸收法 [25]：每浓度各取2 mL培养液加6 mL样品提取液冰镇研磨成匀浆，3000 r/min离心20 min后取4 mL上清液，加1 mL反应液稀释10倍于常温25℃反应10 min后马上于40 nm处测紫外吸光值。对照(CK)中加入1mL反应液、4 mL PBS( pH7.5)。每处理3个重复。
3．观察分析抑菌结果
显微镜观察细胞形态并显微摄影，肉眼计数，采用Excel处理数据。
4. 参考文献
1] 杨清坡, 刘万才, 黄冲. 近10年油菜主要病虫害发生危害情况的统计和分析[j]. 植物保护, 2018, 44, 254(3): 28-34.
[2] 何烈干, 宋来强, 汤洁, 等. 油菜菌核病抗性鉴定方法比较及抗病种质资源的筛选[j]. 江苏农业科学, 2018, 46(18): 90-93．
[3] 冉毅, 文成敬, 牛应泽. 油菜菌核病抗性鉴定方法的比较及抗源的筛选[j]. 植物保护学报, 2007, 34(6): 601-606.
5. 计划与进度安排
1、2022-2022-1学期17-20周～2022-2022-2学期1-2周（2022年11月12日—2022年3月8日），接受任务、查阅和翻译文献，撰写开题报告；
2、第3周~第5周（2022年3月11日～2022年3月29日），完成实验前准备工作，配制各实验所需药品。
3、第6周~第7周（2022年4月1日～2022年4月14日），预实验
