1. 研究目的与意义
背景：目前，甾体类药物中间体的制备主要采用甾醇进行生物转化制备，由于甾醇的水溶性不高，通常采用植物油作溶剂，导致后续分离纯化步骤相对繁琐，有机溶剂（如乙酸乙酯等）用量大，溶剂回收过程产生能耗等，因此，急需探索更加环保的无油工艺进行甾体药物中间体的生产。
甾体激素类药物主要包括性激素、肾上腺皮质激素和蛋白同化激素三大类。甾体激素药物最首要的药效体现在对人类生育能力的改善，其次还具有显著的抗肿瘤、抗炎抗敏、抗菌抗病毒、抗痉挛等效果。由于甾类激素药物对人体机体发挥着十分重要的调节作用，因此该类药物现已成为仅次于抗生素的第二大品种。由于传统化学合成法带来严重的工业污染，并且存在收率低、成本高等问题，极大地限制了甾体激素在药物领域的发展，故近年来利用微生物转化逐渐成为主要发展趋势。
目的：一是通过诱变筛选方法获得优势菌株，二是通过基因工程技术进行菌株改造，三是通过优化调整转化工艺。由于在分子操作方面尚存在一定难度，我们尝试以实验室1 株可转化植物甾醇生成9α-oh-ad 的分枝杆菌 作为出发菌株，采用诱变结合工艺调整和优化的方法提升转化效率， 以提高目的产物9α-oh-ad 的浓度。
2. 研究内容和预期目标
研究内容：目前甾体药物生产中常用的方法有化学合成和微生物转化两种，其中微生物转化法随着研究的深入显示出其巨大的优势。植物甾醇通过与分枝杆菌直接接触进入分枝杆菌，分枝杆菌通过类似β-氧化的循环途径来降解甾醇的侧链，获得雄烯二酮 (ad)，之后ad经3-甾酮-9α-羟基化酶 (ksh)修饰，可以进一步合成9-oh-ad。其中，菌种能力是获得9-oh-ad的关键。为进一步推动9-oh-ad的工业化进程，本项目研究拟将以本实验室已有的分枝杆菌为研究出发菌株，进一步进行诱变筛选，获得高效率转化植物甾醇的突变株。主要研究内容如下：
（1）采用化学方法进行菌种诱变（如紫外诱变，复合诱变等），通过菌种初筛、复筛等，确定诱变条件。
（2）筛选若干株突变菌株，在摇瓶培养过程中分析9-oh-ad的产率，筛选出高转化率的菌株。
3. 研究的方法与步骤
研究方法：运用文献分析法，比较分析法，综合分析法，数学 方法等进行研究。
步骤：1.配置固体培养基，将菌种进行扩培。
2.配置斜面培养基将菌种活化。
4. 参考文献
[1]姚抗.分枝杆菌甾醇代谢机制的解析以及其代谢工程改造应用于制备重要甾药中间体的研究[d].华东理工大学，2014.[2]袁家代，陈贵英，程世君，等.3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9α-羟基雄烯二酮的制备[j]. 生物工程学报，2015，31(4).523-533.
[3]范书玥，魏巍，王风清，等.分枝杆菌mycobacterium sp.nwib-01 3-甾酮-9α-羟基化酶基因的克隆、异源表达及分离纯化[j].生物工程学报，2009，25(12):2014-2021.
[4]wei w, wang f q, fan s y, et al. inactivation and augmentation of the primary 3-ketosteroid- △1 -dehydrogenase in mycobacterium neoaurum nwib-01: biotransformation of soybean phytosterols to 4-androstene- 3,17-dione or1,4-androstadiene-3,17- dione.[j].applied environmental microbiology,2010,76(13):4578-4582.
5. 计划与进度安排
（1）2022-2022-1学期17-20周～2022-2022-2学期第1周～第4周(2022-12-25～2022-03-23)
接受任务，搜集的资料、调查数据并进行整理分析，确定菌株诱变的问题。借助网络资源、查阅相关书籍资料设计实验操作方法，并翻译英文文献。
（2）第1周～第4周（2022-03-15～2022-03-28）
