1. 研究目的与意义
研究背景：
水杨酸（sa）作为一类新型植物生长调节物质,可以由植物体自身合成,但合成量相对较低,通过韧皮部运输,在物开花、侧萌发、生热、性别分化等生长发过程中起着非常要的调节作用。植物体内水杨酸的合成是通过莽草酸先形成肉桂酸,然后经过以下两条途径合成:一种是由肉桂酸首先邻羟基化产生邻香豆酸,再经b-氧化产生水杨酸;另一种是肉桂酸先经b-氧化产生苯甲酸,再经羟化产生水杨酸。水杨酸在植物体内表现形式包括自由状态和结合状态。在细胞间,主要是存在着sa-葡萄糖苷,它是由水杨酸与葡萄糖结合而形成的,在有环境胁迫时它也可以在酶的作用下分解产生自由状态的水杨酸,这些自由态的水杨酸可以进入细胞,对细胞的抗逆反应其他代谢进行必要的调节，而植物细胞内水杨酸满足细胞代谢或超过饱和量时,细胞内会产生udpg-sa-葡萄糖基转移酶,这种酶对水杨酸具有专一性,可以使葡萄糖与自由状态下的水杨酸结合成结合状态。研究发现只有游离的水杨酸才能参与生理调节。此外,sa与植物抗胁迫的关系一直是研究的热点:它在诱导植物对低温、重金属、干旱和盐害等非生物胁迫中会产生一定的抗性,在植物非生物迫的交叉保护反应中占一定的地位。
研究目的：
2. 研究内容和预期目标
本实验研究不同浓度水杨酸对不同浓度铅胁迫小麦幼苗生理特征的缓解作用。主要方法是将小麦幼苗分别在蒸馏水和不同浓度铅溶液（0.25、0.5、0.75、1mmol/l pb2 )下处理，观察小麦幼苗的生长状况和生理指标，以蒸馏水(0mmol/l pb2 )为空白对照组探究各浓度铅对小麦的毒害情况。然后再以各浓度铅溶液组(0mmol/l sa)分别为空白对照组，在分别加入不同浓度的sa(0.25、0.5、0.75、1mmol/l sa)，根据其生理指标的变化来研究sa对铅胁迫的缓解作用。
测定小麦幼苗的以下生理指标：叶绿素含量、根系活力、超氧化物歧化酶(sod)活性、过氧化物酶（cat）活性*，过氧化氢酶（pod）活性，丙二醛(mda)含量、可溶性蛋白质*、可溶性糖含量、和脯氨酸（pro）含量，并作变化曲线。(有*标注未备选方案）
本实验力求客观反映sa对铅胁迫小麦幼苗处理后可能存在的剂量效应和时间效应。
3. 研究的方法与步骤
1.小麦幼苗的处理
将小麦种子用蒸馏水洗，选取籽粒饱满的小麦种子,以75%酒精表面消毒10min,无菌水充分冲洗后,用无菌水侵泡8h后于25℃培养箱中暗发芽7天,7天后选择芽长一致的种子进行不同浓度铅溶液（0,0.25,0.5,0.75,1mol/L）水平处理以及对应的分别加入不同浓度SA（0,0.25,0.5,1mmol/L）竖直对照处理，置于光照培养箱中水培，每天光照14h，温度保持在25℃。
2.叶绿素含量的测定
——叶绿素测定仪法
——分光光度计法
（1）叶绿素的浸提精密称定风干后的样品（约0.1g）于20mL95%乙醇中，在室温浸提36-48h。
（2）叶绿素浸提液定容提取液过滤到50mL棕色容量瓶（如使用白玻容量瓶，可用报纸遮光），用95%乙醇定容至50mL，摇匀，置于暗处备用待测。
（3）测量吸光度取1cm的比色皿，注入上述叶绿素酒精溶液，用95%乙醇为参比液，1cm的比色皿为吸收池，分别在663nm和645nm波长测吸光度，每一波长读三次数，取平均值带入公式计算。如吸光度大于0.8，按倍数准确稀释（稀释倍数为n），尽量使吸光度的测量值在0.2-0.8范围内。
（4）结果计算用测得的吸光度A663、A645，代入ca=12.7A663-2.69A645式计算溶液中叶绿素a的含量；代入cb=22.9A645-4.68A663式中计算得到叶绿素b的含量，代入式cT=（ca cb）=20.2A645 8.02A663计算得到叶绿素量。计算植株中叶绿素含量时，需要考虑稀释因子。
3.根系活力的测定——TTC法
氯化三苯基四氮唑(TTC)是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素溶于水中成为无色溶液但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲(TTF),如下式生成的三苯甲(TTF)比较稳定不会被空气中的氧自动氧化所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强而被丙二酸、碘乙酸所抑制所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标
1定性测定
(1)配制反应液把1%TC溶液、0.4mol/L的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合
(2)把根仔细洗净把地上部分从茎基部切除将根放入三角瓶中倒入反应液以浸没根为度置37℃C左右暗处放1~3h以观察着色情况新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色表明该处有脱氢酶存在
2定量测定
（1）TTC标准曲线的制作取0.4%C溶液0.2mL放入大试管中加9.8ml乙酸乙酯再加少许硫酸钠粉末摇匀则立即产生红色的TTF此溶液浓度为每笔升含有TTF80μg分别取此溶液0.25mL、0.50ml、1.00mL1.50mL、2.00ml置10mL刻度试管中用乙酸乙酯定容至刻度即得到含TTF20μg、40μg、80μg、120μg、160μg的系列标准溶液以乙酸乙酯作参比在485nm波长下测定吸光度绘制标准曲线
（2）称取根尖样品0.5g放入小烧杯中加入0.4%TC溶液和磷酸缓中液(pH7.0)各5mL使根充分浸没在溶液内在37℃下暗保温1~2h,此后立即加入1mol/L硫酸2mL以停止反应.(与此同时做一空白实验先加硫酸再加根样品37℃下暗保温后不加硫酸其溶液浓度操作步骤同上)
(3)把根取出用滤纸吸千水分放入研针中加乙酸乙酯3~4mL充分研,以提出TTF把红色提取液移入刻度试管并用少量乙酸乙酯把残直洗2~3欠皆移入刻度试管最后加乙酸乙酯使总量为10mL用分光光度计在皮长485nm下比色以空白试验作参比测出吸光度查标准曲线即可求出TTC还原量
四、结果计算系活力=C/(1000*W*h)[mgTF/(g*h)]式中:C—四还原量gW—根重gh—时间h
根系活力的测定——甲烯蓝吸附法
根据沙比宁等的理论，植物对溶质的吸收具有吸附的特征，并假定这时在根系表面均匀地吸附了一层被吸附物质的单分子层，然后在根系表面产生吸附饱和，继之，根系的活跃部分能将原来吸附着的物质解吸到细胞中去，继续产生吸附作用。常用甲烯蓝作为吸附物质，它的被吸附量可以根据吸附前后的甲烯蓝浓度的改变算出，甲烯蓝浓度可用比色法测定。已知1mg甲烯蓝成单分子层时占有的面积为1.1m2。据此可算出根系的总吸收面积，从解吸后继续吸附的甲烯蓝的量，即可算出根系的活跃吸收表面积，可作为根系活力的指标。
1.将0.0002mol/L的甲烯蓝溶液(每毫升中含0.064mg甲烯蓝)分别倒入3个小烧杯中，编好号码，每个烧杯中溶
液体约10倍于根系体积(排水法：将根系洗净控干后，放在装有一定体积水的量筒里)。准确记下每个烧杯中的溶液量。
2．将冲洗干净的待测根系，用吸水纸小心吸干(慎勿伤根)，然后依次浸入盛有甲烯蓝溶液的烧杯中，在每杯中浸1.5min，注意每次取出时都要使甲烯蓝溶液能从根上流回到原杯中去。
3．从3个小烧杯中各吸取甲烯蓝溶液1mL，用去离子水10倍后，660nm处比色测OD，在标准曲线上求得各杯中所剩甲烯蓝毫克数，再根据杯中原有的甲烯蓝毫克数，求出每杯中为根系所吸收的甲烯蓝毫克数。
4．甲烯蓝标准曲线的制作：将甲烯蓝溶液1、2、3、4、5、6μ/mL的系列溶液，于660nm处比色测OD，以甲烯蓝溶液浓度为横坐标，OD值作为纵坐标，绘制标准曲线。
5．依照下列公式求出根的吸收面积：
总吸收面积(m2)=(第一杯中被吸收的甲烯蓝毫克数 第二杯中被吸收的甲烯蓝毫克数)×1.1m2
活跃吸收面积(m2)=第三杯中被吸收的甲烯蓝毫克数×1.1m2
活跃吸收面积%=根系活跃吸收面积(m2)/根系总吸收面积(m2)×100%
比表面积（m2/cm）=根系总吸收面积(m2)/根体积(cm3)
4..脯氨酸含量测定——磺基水杨酸法
原理：磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。
实验步骤：(1)脯氨酸标准曲线的制作：取6支10ml容量瓶，编号，按下表配制每管含量为0～6μg的脯氨酸标准液。
取6只带塞试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min，取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度值。以1～6号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。计算2ml测定液中脯氨的含量(μg·ml-1)。
(2)样品的测定：称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r·min-1离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度值。
(3)计算结果：从标准曲线上计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg·ml-1)。样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：
公式中：X－从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μg）
5.可溶性糖含量的测定——蒽酮比色法
①标准曲线制作：取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5－20s加入5mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。②可溶性糖提取：称取0.3g新鲜小麦叶片，剪碎混匀，放入具塞试管中，加入10ml蒸馏水，在沸水浴浸提30min，将提取液过滤入25ml容量瓶，再加入10ml蒸馏水，沸水浴浸提30min，提取液过滤入同一25ml容量瓶，最后漂洗，定容至刻度。
③显色：取0.5ml提取液，依次加入1.5ml蒸馏水，0.5ml蒽酮乙酸乙酯溶液和5ml浓硫酸，振荡后，立即沸水浴，逐管保温1min，自然冷却至室温，在630nm处测吸光度，记录数据。
④结果计算最后通过标准曲线求出可溶性糖的含量（μg），按下方公式计算出被测小麦幼苗叶片的糖含量：
可溶性糖含量（%）=c*v总*n/（v测*w*103）
公式中：C——标准曲线上求得的糖含量（μg）V总——提取液总体积（ml）
V测——吸取样品液的体积（ml）N——稀释倍数W——样品鲜重（g）
6.SOD活性测定——邻苯三酚自氧化法
——氮蓝四唑比色法（NBT氧化还原法）
原理：超氧物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
实验步骤：(1)酶溶液提取取样品0.5g于预冷的研钵中，加入1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加磷酸缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于4000rpm下冷冻离心20min，上清液即为SOD粗提液。
(2)比色反应取5ml指形管(要求透明度好)5支，3支为测定管，另2支为对照管，按下表滴加各溶液：
| 试剂(酶) | 用量/ml | 终浓度(比色时) |
| 0.05mol·L-1磷酸缓冲液 130mmol·L-1Met溶液 750μmol·L-1NBT溶液 100μmol·L-1EDTA－Na2液 10μmol·L-1核黄素 酶液 蒸馏水 总体积 | 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 |
13mmol·L-1 75μmol·L-1 20μmol·L-1 2μmol·L-1 2支对照管以磷酸缓冲液代替酶液 |
(3)混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应15min。反应结束后，用黑布遮罩以上试管，终止反应，以不照光的对照管做空白，分别于560nm处测定其它各管的吸光度，根据公式计算SOD活性。
计算公式：已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)
Ack：照光对照管的吸光度；AE：样品管的吸光度；V：样品液总体积(ml)；
Vt：测定时样品用量(ml)；W：样鲜重(g)；SOD活性以每克鲜重叶片含酶单
7.POD的测定——愈创木酚法
原理：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。
实验步骤：(1)酶溶液的提取：称取萝卜幼苗叶0.5g，加20mmol·L-1KH2PO42.5mL，于研钵中研磨成匀浆，以4000r·min-1离心15分钟，收集上清液保存在冰水中，所得残渣再用20mmol·L-1KH2PO42.5mL溶液提取一次，全并两次上清液。
(2)酶活性的测定：取2只比色皿，于2只中都加入反应混合液3mL，KH2PO475μL，校准基线，然后取出一只测定管加入反应混合液3mL，提取的酶溶液1ml(实际75μL)，混合均匀后点击“开始”，于紫外分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min(实际30s)读数一次，共读取11次。以每分钟OD变化值表示酶活性大小，即以△OD470·min-1.mg-1蛋白质(或鲜重g)表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。
(3)结果计算：以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即△OD470·min-1.mg-1鲜重表示之。也可以用每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。，
式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化。W——植物鲜重，g。VT——提取酶液总体积，ml。Vs——测定时取用酶液体积，ml。t——反应时间，min。
8.MDA含量测定——硫代巴比妥酸（TBA）法
原理：植物器官在逆境条件下或衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。在酸性和高温的条件下，丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮，在532nm处有最大吸收波长。但该反应会受到可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm。植物在经受逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定中需排处前者的干扰，通常加入低浓度铁离子，以显著增加TBA与糖的显色反应产物在450nm处的吸收。
步骤
①MDA的提取：称取0.5g小麦幼苗叶片,加入1mL10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨，再加入4mL三氯乙酸充分研磨,将匀浆液转入离心管,于4000r/min离心10min,上清液即为MDA提取液。
②显色反应及测定：吸取2mL提取液，加入2mL0.6%TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min,迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm处的OD值，对照管以2mL水代替提取液。
③结果计算：
CMDA（μmol/L）=6.45A532－0.56A450
公式中：A450——450nm波长下测得的吸光度值
A532——532nm波长下测得的吸光度值
CMDA——反应混合液中MDA的浓度。
提取液中MDA浓度（μmol/L）=
MDA含量（μmol/g）=
1.小麦幼苗的处理
将小麦种子用蒸馏水洗，选取籽粒饱满的小麦种子,以75%酒精表面消毒10min,无菌水充分冲洗后于25℃培养箱中暗发芽,发芽后选择芽长一致的种子,用完全培养液置于光照培养箱中水培,温度设置为25℃/18℃(昼/夜),每天光照14h。当幼苗长至两片真叶时,选取生长一致的健壮幼苗，进行不同浓度铅溶液（0,0.25,0.5,0.75,1mmol/L）水平处理以及对应的分别加入不同浓度SA（0,0.25,0.5,1mmol/L）竖直对照处理。
2.叶绿素含量的测定——分光光度计法
取叶片0.5g分别置于20个容量瓶中（20个实验组，每组对应一个），然后加入10ml 80%丙酮，塞好盖子，至于避光阴凉处5d。5d后，将丙酮混合液混匀后倒入比色皿中，以80%丙酮作为空白对照，分别在663nm和645nm波长下测吸光度值，每个波长分别测三次，取平均值带入公式。如果吸光度大于0.8，则用80%丙酮稀释，找到合适的稀释倍数（n）后，准确稀释，使吸光度值尽量落在0.2~0.8之间。用测得的吸光度A663、A645，代入ca=12.7A663-2.69A645式计算溶液中叶绿素a的含量；代入cb=22.9A645-4.68A663式中计算得到叶绿素b的含量，代入式cT=（ca cb）=20.2A645 8.02A663计算得到叶绿素量。计算植株中叶绿素含量时，需要考虑稀释因子。
3.根系活力的测定——TTC法
（1）取0.4%C溶液0.2mL放入大试管中加9.8ml乙酸乙酯再加少许硫酸钠摇匀，即得80μg/ml TTF母液，分别取此溶液0.25mL、0.50ml、1.00mL1.50mL、2.00ml置10mL刻度试管中用乙酸乙酯定容至刻度即得到含TTF20μg、40μg、80μg、120μg、160μg的系列标准溶液以乙酸乙酯作参比在485nm波长下测定吸光度绘制标准曲线
（2）称取根尖样品0.5g放入小烧杯中加入0.4%TC溶液和磷酸缓中液(pH7.0)各5mL使根充分浸没在溶液内在37℃下暗保温1~2h,此后立即加入1mol/L硫酸2mL以停止反应.(与此同时做一空白实验先加硫酸再加根样品37℃下暗保温后不加硫酸)
(3)把根取出用滤纸吸千水分放入研针中加乙酸乙酯3~4mL充分研,以提出TTF把红色提取液移入刻度试管并用少量乙酸乙酯把残直洗2~3欠皆移入刻度试管最后加乙酸乙酯使总量为10mL用分光光度计在皮长485nm下比色以空白试验作参比测出吸光度查标准曲线即可求出TTC还原量
（4）结果计算系活力=C/(1000*W*h)[mgTF/(g*h)]
4.脯氨酸含量测定——磺基水杨酸法
(1)取6只带塞试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min，取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻。轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度值。以1～6号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)样品的测定：称取植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，沸水浴10min，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r·min-1离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度值。
(3)计算结果：从标准曲线上计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg·ml-1)。样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：
公式中：X－从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μg）
5.可溶性糖含量的测定——蒽酮比色法
①标准曲线制作：取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5－20s加入5mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
②可溶性糖提取：称取0.3g新鲜小麦叶片，剪碎混匀，放入具塞试管中，加入10ml蒸馏水，在沸水浴浸提30min，将提取液过滤入25ml容量瓶，再加入10ml蒸馏水，沸水浴浸提30min，提取液过滤入同一25ml容量瓶，最后漂洗，定容至刻度。
③显色：取0.5ml提取液，依次加入1.5ml蒸馏水，0.5ml蒽酮乙酸乙酯溶液和5ml浓硫酸，振荡后，立即沸水浴，逐管保温1min，自然冷却至室温，在630nm处测吸光度，记录数据。
④结果计算最后通过标准曲线求出可溶性糖的含量（μg），按下方公式计算出被测小麦幼苗叶片的糖含量：
可溶性糖含量（%）=c*v总*n/（v测*w*103）
公式中：C——标准曲线上求得的糖含量（μg）；V总——提取液总体积（ml）；
V测——吸取样品液的体积（ml）；N——稀释倍数；W——样品鲜重（g）
6.SOD活性测定——NBT光化氧化法
(1)酶溶液提取取样品0.5g于预冷的研钵中，加入1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加磷酸缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于4000rpm下冷冻离心20min，上清液即为SOD粗提液。
(2)比色反应取5ml指形管(要求透明度好)5支，3支为测定管，另2支为对照管，按下表滴加各溶液：
| 试剂(酶) | 用量/ml | 终浓度(比色时) |
| 0.05mol·L-1磷酸缓冲液 130mmol·L-1Met溶液 750μmol·L-1NBT溶液 100μmol·L-1EDTA－Na2液 10μmol·L-1核黄素 酶液 蒸馏水 总体积 | 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 |
13mmol·L-1 75μmol·L-1 20μmol·L-1 2μmol·L-1 2支对照管以磷酸缓冲液代替酶液 |
(3)混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应15min。反应结束后，用黑布遮罩以上试管，终止反应，以不照光的对照管做空白，分别于560nm处测定其它各管的吸光度，根据公式计算SOD活性。
计算公式：已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)
Ack：照光对照管的吸光度；AE：样品管的吸光度；V：样品液总体积(ml)；
Vt：测定时样品用量(ml)；W：样鲜重(g)；SOD活性以每克鲜重叶片含酶单
7.POD的测定——愈创木酚法
(1)酶溶液的提取：称取萝卜幼苗叶0.5g，加20mmol·L-1KH2PO42.5mL，于研钵中研磨成匀浆，以4000r·min-1离心15分钟，收集上清液保存在冰水中，所得残渣再用20mmol·L-1KH2PO42.5mL溶液提取一次，全并两次上清液。
(2)酶活性的测定：取2只比色皿，于2只中都加入反应混合液3mL，KH2PO475μL，校准基线，然后取出一只测定管加入反应混合液3mL，提取的酶溶液1ml(实际75μL)，混合均匀后点击“开始”，于紫外分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min(实际30s)读数一次，共读取11次。以每分钟OD变化值表示酶活性大小，即以△OD470·min-1.mg-1蛋白质(或鲜重g)表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。
(3)结果计算：以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即△OD470·min-1.mg-1鲜重表示之。也可以用每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。，
式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化。W——植物鲜重，g。VT——提取酶液总体积，ml。Vs——测定时取用酶液体积，ml。t——反应时间，min。
8.MDA含量测定——硫代巴比妥酸（TBA）法
（1）MDA的提取：称取0.5g小麦幼苗叶片,加入1mL10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨，再加入4mL三氯乙酸充分研磨,将匀浆液转入离心管,于4000r/min离心10min,上清液即为MDA提取液。
（2）显色反应及测定：吸取2mL提取液，加入2mL0.6%TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min,迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm处的OD值，对照管以2mL水代替提取液。
（3）结果计算：CMDA（μmol/L）=6.45A532－0.56A450
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还原糖含量测定——二硝基水杨酸法
（1）取6支洁净干燥的试管，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml的1mg/ml的葡萄糖标准液，然后用蒸馏水定容至2ml，混匀后静置待用。然后加入2mlDNS反应液，沸水浴5min，立即冷却至室温，最后用蒸馏水定容至20ml，混匀后静置待用。以1号管做空白对照，测定540nm下的吸光度值。测定三次取平均值。然后以葡萄糖含量为横坐标，对应的A540nm平均值为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）称取叶片0.5g加入6ml 80%乙醇，80℃水浴30min后冷却至室温，3500rpm离心10min,取上清液倒入新的洁净干燥的试管中并用80%乙醇溶液清洗研钵数次，清洗液也一并倒入新试管中，最后用80%乙醇溶液定容至25ml。混匀后即为还原糖粗提取液。
（3）取2ml还原糖粗提取液沸水浴蒸干，然后加入20ml蒸馏水溶解，混匀后取2ml再加入2ml DNS反应液，沸水浴5min后，立即冷却至室温，再用蒸馏水定容至20ml，最后测定其在540nm下的吸光度值，测定三次取平均值。
（4）脯氨酸含量=X*Vt/(Vs*fw) [mg*g-1 FW]
X：根据标准曲线查的的脯氨酸含量（mg）；Vt：总测定液体积（ml）；Vs：测定液体积（ml）；FW：样品鲜重（g）
10.可溶蛋白含量——考马斯亮蓝G-250法
（1）取6支洁净干燥的试管，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml的100ug/ml的牛血清蛋白标准液，然后用蒸馏水定容至1ml，混匀后静置待用。然后加入5ml 考马斯亮蓝G-250，摇匀，最后测其在595nm波长下的吸光度值，测三次取平均值。然后以牛血清含量为横坐标，对应的A595nm平均值为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）称取叶片0.5g作为样本，加入少量的蒸馏水研磨后转移到10ml刻度试管中，多次用蒸馏水清洗研钵和玻璃棒并将清洗液也一并转入到试管中，最后用蒸馏水定容至10ml，然后5000rpm离心10min，上清液即为可溶蛋白粗提取液。
（3）取0.1ml可溶蛋白粗提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝，静置2min待显色完全后，以标曲曲线1号管为空白对照，测定A595nm下的吸光度，测定三次求平均值。
（4）可溶蛋白含量=X*Vt/(Vs*FW*1000)
X:由回归方程查的可溶蛋白量（ug）；Vt：总测定液体积（ml）；Vs：测定液体积（ml）；FW：样品鲜重（g）
11.超氧阴离子自由基——羟胺氧化法
（1）取六只干燥洁净的试管分别加入0、10.2、0.4、0.6、0.8、1 ml的亚硝酸钠标准母液，然后用蒸馏水定容至2ml，摇匀后分别加入2ml 17mmol·L-1对氨基苯甲酸和2ml 7mmol·L-11-萘胺,30℃保温30min后，以1号管为空白对照测定其余管在A530nm下的吸光度，测三次取平均值。然后以亚硝酸钠含量为横坐标，A530为纵坐标绘制标准曲线。
（2）用蒸馏水清洗小麦幼苗数次后，擦干，准确称取叶片0.5g作为样本，加入1ml 0.065mol/L磷酸缓冲液（PH 7.8）研磨，研磨后转移到5ml刻度离心管管中，多次用缓冲液清洗研钵和玻璃棒并将清洗液也一并转入到试管中，最后用缓冲液定容至5ml，然后4000rpm离心20min，上清液即为超氧阴离子自由基粗提取液。
（3）取2ml粗提取液加入1.5ml预冷缓冲液，再加入0.5ml 10mmol/L盐酸羟胺（空白组换成缓冲液）,25℃温水浴保温20min后，即为超氧阴离子自由基反应液。
（4）取2ml反应液加入2ml 17mmol·L-1对氨基苯甲酸和2ml 7mmol·L-11-萘胺,30℃保温30min后，加入4ml三氯甲烷萃取，震荡30s,然后4000rpm离心5min。最后取上清以空白组对对照测定其余管在A530nm下的吸光度，测三次取平均值。
（三）结果计算
超氧阴离子自由基含量=X*Vt*2/(FW*Vs)
X：根据标准曲线查的的脯氨酸含量（ug/ml）；Vt：总测定液体积（ml）；Vs：测定液体积（ml）；FW：样品鲜重（g）
4. 参考文献
［1］刘建新.镉胁迫下玉米幼苗生理生态的变化[j].生态学杂志，2005，24（3）：265–268.
［2］李铭心.重金属镉对莲藕生长发育的影响[j].华中农业大学，2005
［3］慈恩，高明，王子芳，吴云，秦建成.镉对紫花苜蓿种子萌发与幼苗生长的影响研究[j].中国生态农业学报，2007，15（1）：96–98.
5. 计划与进度安排
| 2022-2022-1学期 1. 17周（2022-12-25） 接受任务； 2022-2022-2学期 2. 第1周~第2周（2022-03-05 — 2022-03-18） 完成开题准备；上交开题报告； 3. 第1周~第5周（2022-03-05 — 2022-04-13） 完成相关文献资料的查阅综合工作；实验方法的汇总工作；开始实验工作的准备，进行预实验；确定实验方法； 4. 第6周~第12周（2022-04-09—2022-05-25） 论文实验；外文文献翻译； 5. 第9周~第10周（2022-04-30 –2022-05-11） 论文进展中期检查 6. 第12周~第13周（2022-05-21 — 2022-06-01） 完成全部实验，收集实验结果，分析数据，完成论文的初稿撰写； 7. 第14周~第15周（2022-06-04 — 2022-06-15） 完成修改，定稿准备答辩。
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