1. 研究目的与意义
研究背景：
近年来，随着生物技术的不断发展和进步以及研究技术的不断改进和完善，研究方向由一开始原始的形态学水平，后续逐渐发展为细胞水平，生理生化水平，直到现在热门的分子学研究水平。各种研究技术都有各自的优缺点。目前使用最广泛的是dna分子标记技术。主要分为基于蛋白质水平的标记技术和基于dna水平的标记技术，在物种水平上，利用分子标记方法进行研究，可以改变传统的理解物种的方法；在系统层次上研究，则是应用一些分子标记技术来构建系统树。而线粒体基因组是唯一可以提供基因组水平上进行系统研究的分子标记。
线粒体基因组作为一种核外遗传系统，具有小型性，自主性和多态性等特点。学者研究发现其解码体系相对简单，编码效率高，拷贝数多，进化速度快，在鸟类、鱼类和两栖类动物的分子系统学研究中得到了广泛的应用，已成为群体遗传结构，地理变异，系统发育等研究领域有效的分子标记。
2. 研究内容和预期目标
基本内容：
1.鲀科鱼类线粒体基因组dna的分离方法优化；
2. 目的基因的克隆和鉴定；
3. 研究的方法与步骤
1、线粒体dna的提取和纯化
从-80℃迅速取1~2g 肝脏或10~20g 肌肉，加3 倍体积的缓冲液在匀浆器中研磨。分装1.5ml ep管中，（以下所有操作，除特殊说明，均在0~4℃下进行）。冷冻离心机1000g 离心10min。取上清分装于离心管中，12000g~35000g 离心10min，得到线粒体粗沉淀。在线粒体粗沉淀中加入1ml 缓冲液，并用移液器击打沉淀使其完全溶解，然后移至1.5ml ep管中。每管加入1mg/ml dnaseⅠ1μl 及rnaseⅠ20μl 混匀，室温下静置60min后，在每管中加入70μl0.50mol/l edta，12000g~35000g 离心5min，取沉淀，加入800μl缓冲液洗涤沉淀。
离心取沉淀，加入450μlnte 混匀沉淀，加入50μl10%sds 和15μl蛋白酶k轻轻混匀，37℃恒温水浴10min，破膜。加入等体积的饱和酚、氯仿（1:1）轻轻混匀，12000g 离心10min，小心吸取上层水相，去除残留的蛋白，重复此步骤2~3 次，直至中间白色的蛋白层基本没有。水相中加入2 倍体积无水乙醇，离心收集mtdna 沉淀，空气中晾干后，溶于适量te 缓冲液， -20℃贮存备用。
4. 参考文献
[1] 肖武汉, 张亚平. 鱼类线粒体dna 的遗传与进化[j]. 水生生物学报, 2000, 24(4): 228-236.
[2] 郭新红, 刘少军, 刘巧, 等. 鱼类线粒体dna 研究新进展[j]. 遗传学报, 2004 , 31(9) : 983- 1000.
[3] 刘丽, 刘楚吾, 张明辉, 等. 不同保存条件下鱼类组织基因组dna的提取效果分析[j]. 广东海洋大学学报, 2007, 27(6):19-22.
5. 计划与进度安排
（1）2022-2022-1学期17-20周---2022-2022-2学期第1周（2022-3-11），接受任务书。查阅资料，确定所选基因（nd1、nd2），准备开题报告，外文论文翻译。
（2）第2周~第4周（2022-3-12~4-1）综合相关文献资料，撰写开题报告，原材料制备，完成实验前准备工作，配制各实验所需药品；学习提取鱼的基因组dna和扩增线粒体基因nd1。学会使用pcr仪，对pcr反应体系，循环参数进行摸索和调整等措施，学会制胶，学习制备感受态细胞，pcr目的基因。
（3）第5周~第12周（2022-4-2~5-27）完成pcr扩增产物的鉴定与割胶回收，回收纯化产物与载体连接，转化到感受态细胞中，利用白斑筛选阳性克隆，用质粒dna小量试剂盒提取质粒，用双酶切鉴定阳性菌落，阳性菌落质粒dna送到生物公司进行测序。
