1. 研究目的与意义
随着国家经济的转型升级的要求越来越具体细化，环境保护的重要性和必要性显得空前重要。近年来，在印染、化妆品以及造纸等行业所使用的人工合成染料对环境的污染破坏性已经得到广泛认知。如何寻找一种经济、高效、安全的方法降解染料成为研究的热点。人工合成的难降解染料主要是偶氮染料，并且甲基红是较为简单的偶氮染料。相较于物理和化学方法降解染料，生物法具有经济、较为安全的特性。但其也有作用时间较长、染料降解率较低等缺陷。但相较于生物法降解的缺点，其显现出的无法比拟的优点使它成为现在研究的趋势。
偶氮染料是分子中含有偶氮双键的染料，其发色基团是偶氮双键，助色基是羟基、氨基、甲基和硫磺基等。含偶氮染料的废水有cod高、色度高、生化性能差、可处理能力差等特点。常见的处理偶氮染料的菌种有假单胞菌属、产碱杆菌属、气单胞菌属以及黄单胞菌属等功能菌。
由之前的研究表明，杂色曲霉lh1可以降解甲基红，但其中真正起降解作用的酶仍未知。本实验将着重通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式，并使用考马斯亮蓝染色方法来分析和确定此酶，再通过胶回收、氨基酸测序等的分析方法，以确定酶的种类。为接下来的酶的利用提供研究基础。
2. 研究内容和预期目标
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离、分析方法。考马斯亮蓝染色方法具有灵敏度高、特异性强、操作性强以及干扰因素少等优点被广泛用于测定微量蛋白质。本课题将聚焦于非变性聚丙烯酰胺凝胶和考马斯亮蓝的方法，通过不断分析、改进获得较为纯净的目的酶。因为目的酶的大小未知，本实验将比较不同浓度的非变性分离胶、浓缩胶的浓度来确定最佳浓度。
非变性聚丙烯凝胶电泳的时间以及固定按照常规操作即可，但考马斯亮蓝染色根据不同种类的酶有不同的最适条件。本课题还将探讨时间、温度、洗脱液等变量因素对电泳条带显示效果的影响。
经过以上探究后，我将获得一种较为理想的对目的酶的分离、提取方式。再经过对目的酶的结构分析、酶活的测定后，希望获得一种之前未知的对甲基红有降解作用的酶。
3. 研究的方法与步骤
本实验首先提取发酵粗酶液，分析其酶活，然后着重研究对提取的发酵粗酶液的电泳分析。按照以下步骤进行操作：（1）胶室制备；（2）检漏；（3）灌分离胶；（4）灌浓缩胶；（5）点样；（6）电泳；（7）卸板；（8）染色；（9）洗板；（10）观察。
其中的第三步、第四步将通过比较几种不同浓度的分离胶（6%，8%，10%，12%，15%）和5%的浓缩胶来确定最适分离胶浓度。其中的第八步，通过比较不同染色环境（醋酸或者磷酸）、染色时间、染色温度、以及水洗方式以获得最佳考马斯亮蓝染色方法。
电泳条件确定后，回收电泳产物。然后分析电泳产物结构，并再次分析其酶活。最后，收集实验结果，分析数据，完成毕业论文的书写。
4. 参考文献
[1]杨玉华. 灵芝发酵液改善馒头品质的机制及漆酶基因在毕赤酵母内的异源表达[d].河南师范大学,2015.
[2] 胡一杰.physisporinus sp漆酶纯化、性质及对染料的脱色研究[d].华中科技大学, 2014.
[3]陈友枝.pleurotus ferulae发酵产漆酶的研究[d]. 江南大学, 2013.
5. 计划与进度安排
2022.12.01-2022.03.31提取发酵粗酶液；
2022.04.01-2022.04.20分析电泳制胶方式；电泳结束后，洗脱或染色方式的确定；
2022.04.21-2022.04.28电泳条件确定后，回收电泳产物；
