1. 研究目的与意义
水稻作为世界上一种重要的粮食作物,人类对它的研究由来已久。从古代人类对水稻种植方法的改进,到近代杂交水稻的问世,再到如今水稻基因组计划的完成得到3000株水稻基因组测序的文章,水稻作物的研究正在不断地完善之中。而关于水稻在逆境环境下生理代谢变化一直是人们研究的热点。近些年来人们对水稻在酸雨,重金属,uv-b辐射胁迫下生理变化的研究越来越多。中国随着城市化的进程不断地加快,so2的含量增加,已经成为了酸雨(ar)多发的国家之一,酸雨面积已超过国土面积的40%,而ar对水稻的损害巨大。因此在了解到一定浓度的稀土元素对水稻生长起到促进作用时,我们的实验目的就是在酸雨影响无法避免的情况下,给水稻施加稀土微肥,对其生长作用有何种作用,稀土微肥能够在酸雨影响下对水稻生长起何种作用是我们主要研究的目的
大量研究资料表明,ar可影响植物生长的全过程,改变各种代谢酶活性,一定浓度的稀土微肥溶液对作物叶面喷施、浸种、根施不仅有增产效果,而且还有提高抗逆性的作用。本课题以苏州地区优质地产水稻苏香粳3号为研究对象,利用一定浓度的稀土微肥对幼苗期的材料进行叶面喷施,研究模拟ar对水稻苏香粳的各种生理指标的影响及稀土微肥的保护作用,为客观评价酸雨危害及风险提供丰富的基础数据,为进一步在苏州地区推广使用稀土微肥减轻酸雨危害打下基础。
通过本次实验可以得出稀土微肥对ar胁迫下的水稻生长起到何种作用,酸雨之前施用稀土微肥效果与酸雨之后施用稀土微肥哪种效果更好。可以了解到具体影响到水稻体内的哪种生理指标的变化。为后续研究做出一个初步的结论,也为苏州地区水稻种植减轻酸雨的危害如何施用肥料提出些许理论基础。为其增产做出些许的帮助。
2. 研究内容和预期目标
研究内容
对发育期水稻进行4组处理,分别是对照组(水),酸雨组(ar),修复组(ar ce),防护组(ce ar),测量在ar以及稀土微肥不同处理的发育期水稻的各种不同生理指标。包括水稻保护酶体系中的pod(过氧化物酶)活性、sod(超氧化物歧化酶)活性、cat(过氧化氢酶)活性、氧自由基产生速率和mda(丙二醛)含量。
3. 研究的方法与步骤
研究步骤
1、配置模拟酸雨以及稀土微肥,取回水稻幼苗分装在8个盆中,分为四组分别为对照、酸雨、修复以及防护,每组两盆做好标记按照下表喷洒
| 对照 | 酸雨 | 修复 | 防护 |
第一天 | 水 | 水 | 酸雨 | 稀土微肥 |
第二天 | 水 | 酸雨 | 稀土微肥 | 酸雨 |
以上所施加试剂均采用喷洒添加,使用喷雾器均匀喷洒在叶面上,在喷洒稀土微肥溶液时需要添加甘露醇,以便于吸收。在第二次喷洒过后二十四小时,开始第一次进行各生理指标的测定,之后每隔五天进行测定一次总共测三次。每一次测量需要取三个平行组测量,三个平行组误差不宜过大。
2.POD活性的测定
取水稻幼苗1g,切碎置入研钵中,加20mmol/LKH2PO410ml研成匀浆转入离心管中,4000r/min离心10min,取上清液转入试管保存于冷处,残渣再用10mLKH2PO4提取1次,合并上清液并记录总体积(提取酶液的总体积),低温下保存备用。取2只试管编号,1号管加入反应混合液3ml KH2PO41ml作为参比;2号管加入反应混合液3ml 提取的酶液2ml,立即测定2号管OD470值,每隔一分钟计数一次
以每分钟内OD470变化0.0l为1个过氧化物酶活性单位(U),计算2号管过氧化物酶的活性。
POD活性=ΔA470:反应时间内吸光值的变化W:样品重量V:提取液总体积,即5mlVt:测定时所用体积,即1mlt:反应时间
3.SOD活性测定
!--[if !supportLists]--(1)!--[endif]--制备提取液:取水稻叶片,每克鲜重加入2~3ml提取液研磨。13000r/min冷冻离心20min取上清液用活性炭处理后取2ml粗酶液。
!--[if !supportLists]--(2)!--[endif]--自氧化率测定:在一系列20ml试管中加9mlTris-HCL缓冲液工作液,于25摄氏度水浴20min,加40ul于25摄氏度预热的邻苯三酚溶液,立即混匀,25摄氏度保温3min,加入50ul维生素C溶液后于420nm处测OD值(A0)。
!--[if !supportLists]--(3)!--[endif]--酶活性测定:在Tris-HCL缓冲液工作液中预先加一定量SOD稀释液,用上述方法测其OD值(As),但注意不加自氧化终止剂维生素C。
抑制率=(A0-As)/A0*100%
SOD单位活力(U/ml酶)=[(A0-As)/(A0*0.5)]*N/V
4.CAT活性测定
新鲜水稻幼苗1g,加入2-3ml4℃的pH为7.8的磷酸缓冲液和少量石英砂,研磨成匀浆,转移入10ml容量瓶,缓冲液冲洗研钵,并定容到刻度。混合均匀后,于5℃冰箱中静置10min,取上清液4000rpm离心15min,上清液即是过氧化氢酶粗提液。保存至5℃冰箱备用。
将0.5ml的粗酶液稀释十倍,取3支10ml试管,编号1、2、3。1号管为对照,2、3号管为样品测试管,在三支试管中分别加入0.5ml稀释酶液,以及3.8ml磷酸缓冲液;在样品管中加入0.5ml稀释酶液,3.5ml磷酸缓冲液。25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度OD1,取出来在试管中混匀去气泡,在2min30s后,测出OD2。按照下列公式计算:
以一分钟内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。
过氧化氢酶活性(u/g*min)=
式中A240=
OD1—刚放进去的的吸光值;OD2—2min30s之后的吸光值;
Vt—粗酶提取液总体积(ml);V1—测定用粗酶液体积(ml);
FW—样品鲜重(g);0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位(u);
t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
5.氧自由基的测定
制作标准曲线:亚硝酸根标准曲线的制作,母液配制0,5,10,15,20,25,3μmol/LNaNO2各2ml,分别加入2ml对氨基苯磺酸和2mlα—萘胺,25℃保温20min,测OD530和[NO2-]互为函数作图。
植物提取液的制备:取水稻叶0.2g,加4ml磷酸缓冲液充分研磨,10000r/min,上清定容至10ml。
O2-产生速率的测定:0.5ml样品提取液 0.5ml磷酸缓冲液 1.5ml盐酸羟胺,摇匀,25℃保温1h,加2ml对氨基苯磺酸 2mlα—萘胺,混匀,25℃保温20min,测OD530。
结果计算:O2-产生速率=(C*Vt*N)*2/(m*t)
6、MDA含量测定
取各组水稻幼苗剪碎,分别称取剪碎的水稻苗1g,各加入2ml10%TCA和少量石英砂,研磨至匀浆,再加入8mlTCA进一步研磨,将匀浆倒入离心管在4000r下离心10min,上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水),加入2ml0.6%TBA溶液,混匀物于沸水浴上反应15min,迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm和450nm波长下的吸光值。每组测量分别进行三次测量得出结果。
MDA(μmol/g)=MDA浓度(μmol/L)*提取液体积(ml)/植物组织鲜重(g)
4. 参考文献
[1]范金凤,曾淑平,梁婵娟,周青.la(Ⅲ)与酸雨对大豆幼苗生长的复合影响[j].大豆科学,2009(28):745-747
[2]李松克,余常水,张春林.稀土不同喷施浓度对水稻产量和性状的影响[j].贵州农业科学,2002,30(s1):26-27.
[3]彭莹,王慧敏,周青.镧对酸雨胁迫下水稻萌发种子pod与质膜透性动态变化的影响[j].环境化学,2009,28(2):254-256.
5. 计划与进度安排
1.2022-12-25选题,接受任务;
2.2022-12-26—2022-03-6完成开题准备;
3.2022-03-7—2022-03-11上交开题报告;
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