1. 研究目的与意义
暗纹东方鲀（takifugu obscurus），属硬骨鱼亚纲（osteichthyes）、鲀形目（tetrodontiformes）、鲀科（tetraodontidae）、东方鲀属（takifugu），系北太平洋西部地区性分布的鱼类。东方鲀属约22种，多为中国特有的地方性鱼类，分布范围较窄，分化较大。[1]
线粒体dna是分子生物学研究中的一个热门领域,已成为鱼类进化生物学和群体遗传学研究的重要分子遗传标记。[2]动物线粒体dna（包括鱼类在内）是一种环状、共价闭合的超螺旋分子，呈母系遗传特性、无组织特异性、进化速率快等特点，已广泛应用在物种起源及遗传分化、种内种间系统发生关系、种内多态和地理分布关系、种质评估、原始鉴定等方面研究。d-loop为mtdna上最重要的非编码区，受进化的压力较小，进化速率是mtdna其他区段的2~5倍，被认为特别适用于相近物种种间或种内的遗传多样性分析。在pcr技术未被广泛应用于mtdna研究之前，大多数依据mtdna信息的关于鱼类种群结构和系统发生的研究多基于rflp的分析。随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是pcr技术结合自动化测序技术的发展，已有众多工作者将d-loop作为分子标记应用于鱼类种内遗传分化的研究。[3]
本研究将克隆和收集鲀科鱼类系统学研究中应用较广泛的分子标记控制区序列。研究成果为进一步深入研究鲀科鱼类线粒体基因组的结构与功能、鱼类分子进化、种群间的联系打下基础。实验拟以暗纹东方鲀组织dna作模板进行d-loop基因序列克隆和分析，并与genebank中多种鲀科鱼类进行同源性比较分析，进一步探讨鲀科鱼类系统进化和物种形成方式。
2. 研究内容和预期目标
1. 暗纹东方鲀线粒体基因组模板准备；
2. d-loop基因序列的克隆；
3. 扩增产物的回收及阳性克隆的筛选
3. 研究的方法与步骤
(一) 暗纹东方鲀基因组全序列的提取
1.1 实验材料和试剂：
选取暗纹东方鲀，活体解剖取肝脏或肌肉，用ste缓冲液漂洗后，-80℃保存备用。
限制性内切酶为takara公司产品，dnase i、rnase a、protinase k为sigma公司产品，其他试剂均为分析纯产品。
4. 参考文献
[1] 邵爱华, 朱江, 史全良, 等. 暗纹东方鲀线粒体dna控制区结构和系统发育分
析[j].中国水产科学,2007,14(3):352-360.
[2] 郭新红, 刘少军, 刘巧, 等. 鱼类线粒体dna研究新进展[j]. 遗传学报, 2004 , 31(9) : 983-1000.
5. 计划与进度安排
1、2022年2月25日～2022年3月25日，接受任务、查阅和翻译文献、撰写及完成开题报告。
2、2022年3月26日～2022年4月10日，原材料制备，完成实验前准备工作，配制各实验所需药品；学习提取鱼的基因组dna基因，学会使用pcr仪，对pcr反应体系，循环参数进行摸索和调整等措施，学会制胶，学习制备感受态细胞，pcr目的基因。
3、2022年4月11日～2022年5月1日，完成pcr扩增产物的鉴定与割胶回收，回收纯化产物与载体连接，转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，利用白斑筛选阳性克隆，用质粒dna小量试剂盒提取质粒，用双酶切鉴定阳性菌落，阳性菌落质粒dna送到生物公司进行测序。
