1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
球头三型孢菌（trichosporonoides oedocephalis）作为一种非常有潜力的多元醇生产菌株，它能够产生赤藓糖醇、甘油和核糖醇等多种多元醇，并且能耐较高浓度葡萄糖等产生的高渗透压。赤藓糖醇产生菌主要从土壤、新鲜花粉、蜂蜜及蜂巢中分离出来。利用高浓度的葡萄糖培养基（葡萄糖浓度为40%~50%),选择存活菌种接种于中浓度葡萄糖培养基（20%~30%)中进行发酵，再利用薄层层析和高效液相色谱等方法分析筛选出的赤藓糖醇产生菌，并测定其产量，筛选出高产菌种。国外对于赤藓糖醇菌株的选育方面研究较早。1956年加拿大科学家spencer等人在研究高渗酵母产生甘油时，发现由于菌种的生长速度及培养条件的不同，可产生赤藓糖醇。1964年hajny等人从新鲜花粉中分离出一株圆酵母（torula sp. )，转化率达到35%~40%。1989年ishizuka等人筛选出 aureoasidi-um sp.sn-115菌株。1993年marina等人从蜂巢中分离出 trichosporonoides sp.150-5和331-1，它们可利用葡萄糖或蔗糖作为碳源发酵产生赤藓糖醇，转化率分别为30%和43%。1996年kim等人从蜂巢中分离出一株 candida magnoliae,转化率为20%。1998年jin等人从蜂巢中分离出一株 trichosporon sp.，该菌的转化率达到47%。1999年hirata等人从新鲜花粉中分离出一株 ustilaginomycetes sp.618a-01，该菌在发酵过程中不会产生副产物甘油及阿拉伯糖醇等其他多元醇，且发酵起泡现象不明显。2001年lin等人从花粉和蜂蜜等中分离出6株高渗酵母（moniliella sp.),转化率达37%.2009年jeya等人从污泥中分离出一株p.tsukubaensis kn75，利用葡萄糖作为碳源，经补料分批发酵，其转化率达到61%,是迄今报道赤藓糖醇产生菌中产量的最大者。国内起步较晚，吴艳等人(2001)、陶军玮等人(2003)、杨晓玮等人(2005)及叶娴等人（2007)先后从不同来源中分离得到赤藓糖醇的产生菌，但产率均偏低。经过众多研究总结发现，赤藓糖醇的生产菌株可分为酵母菌、霉菌和细菌。其工业生产中以耐高渗酵母发酵为主。目前国内外研究人员，主要在筛选出高产菌株的基础上，对其发酵培养基、发酵条件和发酵方式等条件进行优化，进一步达到高产的目的。
spencer等人研究发现：赤藓糖醇的主要合成途径是6-磷酸葡萄糖脱氢脱羧转化成5-磷酸核酮糖，磷酸戊糖在磷酸戊糖异构酶及差向酶的作用下同分异构化生成5-磷酸核糖和5-磷酸木酮糖，产物在转酮酶（transketolase)作用下经转酮反应生成7-磷酸景天酮糖，7-磷酸景天酮糖再在转醛酶（transaldolase)作用下通过转醛反应将三碳单位转移到3-磷酸甘油醛的c1上，生成4-磷酸赤藓糖，4-磷酸赤藓糖经赤藓糖醇还原酶（erythrose reductase)还原合成赤藓糖醇。由于赤藓糖还原酶催化最后一步反应，因此被认为是关键酶。ishizuka 等人在研究短梗霉产赤藓糖醇时发现，赤藓糖醇由4-磷酸赤藓糖脱磷酸，再由赤藓糖还原而成，该反应由赤藓糖醇还原酶催化进行。基因erl、er2、er3,在大肠杆菌中进行了表达。koba-yashi对高渗环境下三个基因的表达和功能进行了研究，发现在erl和er2起始密码子的上游2kbp处有一个渗透压响应元件（stre),而er3分别在起始密码子上游的148和40 bp处各有一个stre，分析发现er3表达的酶对渗透压的响应更敏感。将细胞放在高渗环境中，在1. 5h内细胞内甘油及3-磷酸甘油脱氢酶的表达量很高，到24h左右，er3及赤藓糖醇才开始产生，表明t.megachiliensis 优先以甘油作为渗透剂。因此，在大部分赤藓糖醇菌株中，甘油是主要的副产物。deng等分离纯化到一株产赤藓糖醇 moniliella sp.bh010,将其er基因进行克隆后发现与t.megachiliensis 具有很高的同源性，与醛酮还原酶超家族属于同一酶系。现已发现的大部分赤藓糖还原酶均属于醛酮还原酶家族（akr),akr 成员都是单体胞质蛋白，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nadph)为辅酶。dae hee对 candida magnolia jh110中er酶的一级结构及基因序列进行了分析，由849个核苷编码了分子质量为31. 4 kda的多肽，它是典型的akr家族nadph依赖型醛酮还原酶，其氨酸酸序列中的252lys、255thr、258arg 被认为是nadph 依赖型所必需的结构条件。lee jk发现了一种新型的er酶，该er酶具有即能利用nadph也能利用nadh的双辅酶特异性，nadh(kca/km=450mm-'s-')的特异性比nadph(kc/km=5. 5mm-'s-')高上百倍。而 leuconostoc oenosnadh,与常见的akr家族酶不一样。菌株中的er酶辅因子是酶通常具有催化同类底物的功能，er酶也能催化众多的酮糖成醇，jungkul研究了从 torula corallina中分离出的er酶的底物特异性，对赤藓糖、木糖、果糖、核糖、阿戊糖的活力分别为15. 32、0．28、0. 23、0. 18和0. 09 u/mg蛋白，而对葡萄糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖则没有活力，正是因为er酶较高的特异性，不会催化产生其它多元醇，所以得到高产量的赤藓糖醇。hiroaki在研究 aureobasidi-um sp. 的突变株中发现，er酶能同时催化生成赤藓糖醇和甘油，ag 和z㎡ 离子会强烈抑制该酶的活力（抑制率70%~80%),cu2 、fe2 、fe3 、a13 也有一定抑制作用（30%~40%)。氧气对赤藓糖醇的高产也是必需因素，maria发现赤藓糖醇与甘油的产量受到含氧量的强烈影响，厌氧条件下leuconostocoenos 虽然也能产生赤藓糖醇，但却比有氧时下降30%,而副产物甘油增加了70%。
赤藓糖醇（erythritol)又名赤藓醇、原藻醇、赤兔草醇，是一种广泛存在于自然界中的天然糖醇类甜味剂。赤藓糖醇口感清凉、热值低、安全性高，在食品领域，如糖果、巧克力、饮料、乳制品生产中的应用最为广泛。赤藓糖醇在医药领域也极具潜力，口腔中的细菌不能利用赤藓糖醇，不会发酵产生乳酸及不溶性葡聚糖，所以可用于牙膏等洁齿用品，保护口腔健康;此外，赤藓糖醇分子量小，速溶性强，溶解吸热带来清凉舒适感，可矫正某些药品的苦味、涩味等，是药品、保健品中的良好矫味剂与赋性剂。在化工行业，赤藓糖醇可以作为有机合成中间体，合成多种功能化合物，如树脂、材料、表面活性剂等。鉴于赤藓糖醇具备的多种作为甜味剂的优良特性，国内外对该产品的需求量也在与日俱增，我国生产赤藓糖醇的厂家主要有山东保龄宝生物技术有限公司、广州施健生物科技有限公司等。赤藓糖醇的生产方法有化学合成法、微生物发酵法和生物提取法等。化学合成法由于流程长，主要是将淀粉用高碘酸法氧化成双全淀粉，再经氢化裂解，生成赤藓糖醇和其他衍生物，且它的成本高，不安全，因此不采用此法合成。与化学合成法相比，微生物发酵法更易被控制，且更具有生产优势，所以微生物发酵法是目前工业化生产赤藓糖醇的唯一办法。目前的研究大部分从获得高产菌株及改善发酵条件的角度来达到最终的高产，而其合成途径及此过程中起主要调控作用的关键酶却少有研究。本次实验主要针对球头三型孢菌赤藓糖还原酶的活性研究，重点探索了nadph的改变和同工酶的研究对赤藓糖还原酶的影响。本文的研究可为提高赤藓糖还原酶的活性调控提供有价值的参考。
2. 研究的基本内容和问题
赤藓糖醇为国际认可的食品添加剂，球头三型孢菌可以用来生产赤藓糖醇、核糖醇等多元醇。本课题对球头三型孢菌中的关键酶赤藓糖还原酶进行活性调控研究。具体研究内容如下：
1）将斜面培养保存的球头三型孢菌进行活化培养。
2）通过nadph的改变对赤藓糖还原酶的活性进行调控。
3. 研究的方法与方案
一、研究方法
1.1赤藓糖发酵菌种国内外发展
赤藓糖醇产生菌主要从土壤、新鲜花粉、蜂蜜及蜂巢中分离出来。利用高浓度的葡萄糖培养基（葡萄糖浓度为40%~50%),选择存活菌种接种于中浓度葡萄糖培养基（20%~30%)中进行发酵，再利用薄层层析和高效液相色谱等方法分析筛选出高产量的赤藓糖醇产生菌。
4. 研究创新点
[1]shie-jea lin,chiou-yen wen,pei-ming wang,jang-cheng huang,chi-liang wei,jin-wei chang,wen-shen chu. high-level production of erythritol by mutants of osmophilic moniliella sp.[j]. process biochemistry,2010,45(6).
[2]tetsuya ookura,keiko azuma,kenji isshiki,hajime taniguchi,takafumi kasumi,yukio kawamura. primary structure analysis and functional expression of erythrose reductases from erythritol-producing fungi (trichosporonoides megachiliensis sng-42)[j]. japan society for bioscience, biotechnology, and agrochemistry,2014,69(5).
[3]jung‐kul lee and kwang‐won hong and sang‐yong kim. purification and properties of a nadph‐dependent erythrose reductase from the newly isolated torula corallina[j]. biotechnology progress, 2003, 19(2) : 495-500.
5. 研究计划与进展
1）2021-03-01～2019-03-07：查阅资料撰写开题报告；
2）2021-03-08～2021-03-18：将斜面培养保存的球头三型孢菌进行活化培养。
3）2021-03-19～2021-04-15：通过nadph的改变对赤藓糖还原酶的活性进行调控。
