苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶A突变体催化制备稀有糖开题报告

背景：稀有糖（Rare Sugar）是自然界中存在但含量极少的一类单糖（糖的最小单位）和糖醇（2002年国际糖协会ISRS定义），其味类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜昧协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，可以弥补传统甜味剂的不足，对改善特殊人群的饮食起到重要作用。

这些年来，人类健康问题受到大众和学界越来越多的关注，人类对健康活性物质的需求也日趋多样化，开发更多的功能性物质受到人们的青睐。稀有糖由于其在生理功能上的独特作用，在医疗、保健品和食品等领域的应用越来越受重视。它们除具有低热量特点，还在抑制血糖升高与体脂积累、清除自由基、神经保护等诸多方面发挥着重要生理活性作用，是糖尿病及肥胖症人群的新型甜味剂，还能修饰药物或活性物质从而优化其功能活性，可以用作多种抗病毒药物制备的中间体。也因此，稀有糖理化性质、生理功能和生产应用已成为国内外研究关注的热点问题。

由于其在自然界中含量稀少，因此绝大多数稀有糖制备是由常见单糖通过生物转化或者非糖化合物的化学合成等手段实现。化学合成法由于其生产设备相对完善，并且大批量生产技术相对成熟，在目前的工业生产中占有主导地位。但是由于化学合成法的非选择性、存在副产物和有机溶剂导致的环境问题，使得化学法制备稀有糖的前景受到了限制，因此探索生物法制备高价值稀有糖的需求日益显著。

L-核酮糖：L-核酮糖是高价值稀有糖，它是合成抗病毒药物的重要前体。L-核酮糖 (L-ribulose) 是一种重要的稀有功能性单糖，其分子式为C₅H₁₀O₅，它可以经过一步生物催化转化直接制备得到L-核糖，目前L-核糖已经广泛用于制备具有良好抗病毒活性的核苷类似物，有多个L-核糖的核苷类似物处于Ⅱ期或者Ⅲ临床，有的则已经上市。因此，L-核糖和L-核酮糖的市场需求都将不断增加。L-核糖是重要的药物合成中间体, 可用于合成具有抗病毒活性的核苷类化合物, 在抗艾滋病、抗病毒中间体方面显示强大的潜能。L-核糖具有良好的抗肿瘤抗病毒能力且对正常细胞的毒副作用很小。L-核糖经还原脱氧水解等加工还可生产2-脱氧-L-核糖, 该中间体与腺嘌呤等有机碱形成的核苷衍生物在癌症、乙肝、丙肝等疾病的治疗方面也具有很大的应用前景。随着L-核糖应用面的不断扩大, 全球L-核糖的需求量逐年增加, 人们对制备和开发适应工业化生产L-核糖方法的兴趣日益浓厚。L-核糖的制备方法有化学合成法与生物合成法。

化学法：L-核糖的化学合成通常以较廉价的糖为原料，虽然在合成步骤与收率等方面均有了较大的提高, 但仍存在合成工艺路线复杂、反应步骤繁琐、试剂昂贵、总收率低、需使用大量有机溶剂和产生有害的副产物等问题, 难以适应工业化生产的要求。

生物法：生物转化合成L-核糖具有立体选择性好、反应条件温和、污染少等特点。根据原料不同可分为两类:以核糖醇为原料和以L-阿拉伯糖为原料的生物合成法。以核糖醇为底物, 可采用两步法转化生产或者一步法转化生产。两步法用到的酶是核糖醇脱氢酶和L-核糖异构酶，一步法则是NAD依赖型甘露醇-1-脱氢酶。以L-阿拉伯糖为原料制备L-核糖，先用L-阿拉伯糖异构酶，再利用重组L-RI菌株。近年来，有一种独特的由L-阿拉伯糖产L-核糖的方法，主要涉及2种酶催化剂:L-AI和甘露糖-6-磷酸异构酶。

核糖：D-核糖是一种天然戊醛糖，是tRNA、mRNA、rRNA的组成部分, 与磷酸作用存在于一切活的生命体中。由于D-核糖 (别名异树胶糖、呋喃核糖) 能够转化为核黄素和核苷酸, 所以被广泛应用于食品、医药、化妆品及动物饲料中。D-核糖最早由相关研究人员从酵母RNA的组分及青霉素的培养液中发现。D-核糖的制备方法有抽取法、化学合成法、生物发酵法等。抽提法, 即从自然物 (RNA) 中直接提取, 是最早用来获得D-核糖的方法，这种方法成本高且得到的产物少。生产成本较高, 不利于工业规模化生产。初期利用汞极电解制备, 后对合成法进行改进由葡萄糖经七步反应过程制得D-核糖。由于汞电极对环境造成严重污染, 因此该法不被人类提倡。后又有人提出可用锌电极或铂电极代替汞电极, 但收效甚微。D-阿拉伯糖遇到铝酸盐后加热可以异构形成D-核糖, 并且在含碳原子数小于五的醇溶液中制得的D-核糖能够直接合成维生素B2。这种方法异构率高, 副产物也多。生物发酵法指通过微量元素、无机物或碳源为原料合成D-核糖。制备D-核糖的原料可以是麦芽糖、乳糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉等, 也可以是蛋白胨、干酵母、玉米浆、大豆粉、硫酸铵、无机盐以及适量微量元素等。野生菌生产D-核糖、突变菌株生产D-核糖、基因工程菌生产D-核糖。国外在Sasajima等之后, 研究者对转酮醇酶变异株又进行多次诱变育种, 培育出D-核糖的高产菌株，产量高达90mg/m，D-核糖发酵技术日趋成熟。国内1992年开始，以对核苷酸的研究为基础, 江苏微生物研究有限公司发起了D-核糖的研究工作，以突变株Bacillus subtilis JSIM-1018为例, 对其培养条件不断研究改进, 可以得到92mg/m L药瓶D-核糖产量，而且我国的D-核糖生产菌种以及发酵生产工艺申请专利并成功授权, 专利号为ZL95112736.5。

目的：基与国内外研究稀有糖进展进行实验，了解稀有糖的应用价值，以及目前稀有糖制备方法的优缺点；了解生物酶法的催化原理及定点突变的意义。熟悉掌握分子定点突变相关实验、微生物的培养、高效液相色谱仪的使用等。

意义：对制备稀有糖的酶进行分子改造，解析相关酶的催化机理与机制，从而开发更加高效、优质的酶，用于稀有糖的生产，对于改善稀有糖生产制备技术与条件以及推进稀有糖的应用都有深远意义。在稀有糖的研究和应用过程中, 难点是对其产业化生产。化学法生产稀有糖因合成路线繁琐、原料药品昂贵、产率低、副产物多等缺点, 而难于推广至工业生产。这就需要研究者们努力探索一套低成本、高收率获得大量稀有糖的化学合成路线, 并推广应用。目前, 生物转化法利用丰富廉价的自然资源, 如淀粉、木材和乳清等作为原料来生产稀有糖, 具有低成本、立体选择性高、对环境友好等优点, 符合发展绿色化学、环保化学的路线, 所以, 将来生物法制备稀有糖很有可能会代替化学合成法。

1. 感受态的制备：将菌种于LB培养基中复活培养，1%的接种量转至新LB培养基中培养，当菌体浓度OD₆₀₀为0.35时停止，取1mL培养基液，加入预冷的1.5mL EP管中，冰上冷却。在4^oC、4500 r/min下低温离心10 min，弃去上清液收集沉淀，加入预冷的0.1M的CaCl₂-MgCl₂溶液（80mM MgCl₂，20mM CaCl₂）重悬菌体沉淀。在4^oC、4500r/min下离心10min，收集沉淀，将EP管倒置。加入0.1M CaCl₂(含有15%甘油）重悬菌体，100μL每管分装，-70^oC保存待用。

2. PCR扩增OsRpiA基因：采用PCR试剂盒得到目的基因片段。PCR条件如下：预变性（94^oC，10min），变性（94^oC，30s），退火（58^oC，30s），延伸（72^oC，60 s），扩展（72 ^oC，10min）。

粗酶提取：将甘油管中突变菌株取200μL接入含5~10μL卡那抗生素的5mL新LB培养液中，于37^oC，200 r/min进行活化，过夜，取500μL菌液接入50mL新LB摇瓶中于37^oC，200 r/min培养。菌体浓度OD600为0.6时（约3h），加入的IPTG诱导剂于19^oC，200 r/min下诱导表达OsRpiA蛋白，约20h后，将50mL菌液于8000 r/min，4 ^oC离心15 min，去培养基，并用磷酸缓冲液洗2-3次，加4 mL裂解液重悬菌体后超声破碎（4^oC，工作2 s，间隙3 s，总时间15 min，功率40%），待破碎液清亮透明时低温离心（11000-12000 r/min，20min，4^oC）以保持酶的活性，去除菌体细胞沉淀、收集离心后的上清液用于蛋白纯化。

3. 镍柱纯化：采用碧云天蛋白纯化试剂盒进行纯化，用裂解液将50% BeyoGoldTM His-tag Purification Resin于4^oC下离心2-3次弃去储存液，平衡凝胶。将4 mL粗酶液与1 mL 50% BeyoGold TMHis-tag Purification Resin混匀于4^oC侧摇过夜后装柱。使用非变性洗涤液（5 mM的咪唑和50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl）进行洗涤，然后使1倍柱体积的含50 mM的咪唑的洗脱液将目的蛋白洗脱后4^oC保存，纯化操作均需在低温下进行。

4. 透析袋过滤：收集纯化液，在4^oC下，使用透析袋（截留相对分子质量为3.5 kDa）对纯化液进行过滤去除咪唑。将得到的重组酶测定浓度，于4^oC备用。

5. 酶的检验：采用SDS-PAGE检验纯化效果。SDS-PAGE蛋白电泳：蛋白电泳液使用甘氨酸缓冲液，蛋白上下层胶的配置，均按照SDS-PAGE凝胶试剂盒指南配制。

6. OsRpiA突变体酶学性质测定：以L-核糖、D-核糖、D-阿洛糖底物，通过高效液相色谱仪及示差折光检测器确定转化效率。将反应样品在100 ^oC下水浴灭活5 min，离心（15000 r/min，10 min），然后通过0.22 μm膜过滤。上清液通过配备Sugar-PakTM色谱柱（6.5×300 mm，Waters）和折光率检测器的Agilent 1120 HPLC进行测试，然后在80 ^oC下用0.3mL/min的超纯水洗脱。

7. 根据色谱图分析，并通过蛋白结构水平上解释可能的原因。

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2）2021-3-20～2021-3-31：活化实验室保存菌种OsRpiA;

3）2021-4-1～2021-4-18：完成定点突变及其突变结果测定;

4）2021-4-19～2021-4-28：完成OsRpiA及其突变株目的蛋白的制备及验证;

5）2021-4-29～2021-5-15：通过高效液相色谱仪及示差折光检测器分析该突变体催化L-核糖、D-核糖、D-阿洛糖的相对酶活；

6）2021-5-16～2021-5-21：整理实验数据;

7）2021-5-21～2021-6：撰写论文，完成答辩ppt，准备答辩。