保存期对复合菌肥微生物群落结构的影响开题报告

随着现代农业迅猛发展，伴随着农田土壤质量受到严重影响。由于农药与化肥的超量使用，提高农作物产量同时，也大大增加了生产成本，影响产品安全性评价，对环境也造成了极大危害，这就促使越来越多科学工作者积极探索应用微生物肥料来替代或部分替代农药和化肥的增产效应。微生物肥料又叫做生物菌肥，是一类具有微生物活体的肥料，其肥效来源主要依靠微生物生命活动及其代谢产物。微生物肥料主要作用机制包括：1) 提高土壤肥力；2) 刺激和调控植株的生长；3) 固氮作用；4) 对铁元素的吸收；5) 有助于农作物吸收营养物质， 改善农作物的品质。复合微生物肥料作为新型的具有发展前景肥料，集有机肥、 化肥及微生物肥料优点于一身。其种类包括：1) 不同菌株复合；2) 菌株与营养物质复合；3) 菌株与载体复合。

高通量测序技术是研究微生物群落遗传多样性及种群动态性的有效手段。此方法打破了传统微生物培养方法的局限性的同时，对微生物种群也可以进行定性与定量分析；并被证实在研究自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性以来，此技术已用于土壤、活性污泥、生物膜、动物肠道、湖泊等环境微生物生态学的研究以及传统食品酿造等微生物群落的分析研究中。

微生物肥料是多种微生物通过一定比例混合在一起所形成的微生物制剂，应用于农业生产中，有特定的肥料效应，而这种效应的产生，活的微生物起到关键作用，它们参与了大部分重要的营养元素的转换和循环过程。但微生物易受时间以及生存环境如温度、pH 等因素影响，其生态结构也会发生变化。因此，研究微生物肥料中微生物的群落结构和多样性对探究微生物肥料中的优势菌株有着重要的意义。对复配得到的复合微生物固体菌肥进行 PCR-DGGE 分析，探究该固体菌肥在3 个月保存后，其微生物群落结构。

1、理论意义为微生物肥料的微生物种类增添新品种，为微生物肥料生产过程前提供优质高效的微生物菌株。并为后续工业化生产中提高有效菌株的存活性和高性能性。 微生物肥料本身具有可持续利用性，符合国家政策，且微生物肥效均衡、本身无毒、不污染环境、成本低、节约能源，为环境土壤修复起着重要的作用。

2、应用价值为微生物肥料工厂在液态发酵过程中，提供切实可行的试验数据。并为工业化生产提供不同微生物肥料的剂型，以提高微生物肥料在使用过程中的有效性。 微生物肥料逐步成为我国国家生态示范区、绿色和有机农产品基地等肥料的重要 趋势，希望能够成为替代化学肥料的有效载体，同时具有相当的经济效应、社会 效应和生态效应。

菌肥是多种微生物通过一定比例混合在一起所形成的微生物制剂，应用于农业生产中，有特定的肥料效应，其中的活性微生物起到关键作用，它们参与了大部分重要的营养元素的转换和循环过程。但微生物群落易受保存时间以及环境如温度、pH等因素影响，其群落结构和功能也会发生变化。因此，研究微生物肥料中微生物的群落结构和多样性是否稳定是评价菌肥可靠性的重要指标。

高通量测序技术是研究微生物群落遗传多样性及种群动态性的有效手段。此方法打破了传统微生物培养方法的局限性的同时，对微生物种群也可以进行定性与定量分析；并被证实在研究自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性以来，此技术已用于土壤、活性污泥、生物膜、动物肠道、湖泊等环境微生物生态学的研究以及传统食品酿造等微生物群落的分析研究中。

本论文的主要研究内容如下：

1、菌种活化及扩培；

2、菌肥的复配及存放；

3、菌肥总DNA提取、高通量测序；

4、数据统计分析。

1.试验材料准备：

1.1实验样品：实验室冷冻储存的活体菌

1.2细菌16SrRNAV3区域通用引物，上游引物GC-F341 ： CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG；下游引物 R518：ATTACCGTGGCTGCTGG。由上海生工生物工程有限公司合成。

2.菌体驯化

2.1 用塑料管粘合成一个5升的柱状反应器并在上下两端接好进出水导管，在柱子底部铺好鹅卵石加入颗粒硫和种泥（已生活污水曝气池的污泥为种泥）的混合物并用自制模拟生活污水（硝酸钠1.214g，碳酸氢钠2g，二水磷酸二氢钠0.007g。微量元素2mL，大量元素2mL）喂养。驯化过程中将反应器放入恒温培养箱将温度调节为恒定30℃。2.2 用蠕动泵以恒定流速从底部向反应器中注入模拟生活污水，流速设定为2.5L/24小时。用上方导管接收水样测量样品ph值并对其进行抽滤，取上清，分别测量其相关理化性质，包括总氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮、硫酸盐。

3.DNA 提取

3.1 DNA 提取：使用DNA快速提取试剂盒(购自 TIANGEN)提取DNA，提取步骤主要是：

1)取 750μL Buffer SA 与 0.25g 玻璃珠于 2mL 离心管中；

2)在上述离心管中加入样本 0.25g，涡旋混匀 15s；

3)向样本中加入 60μL Buffer SC，涡旋震荡 10min 至样本混匀；

4)12000r/min 离心 1min。转移上清液至新的 2mL 离心管中；

5)加入 250μL Buffer HA，涡旋 5s，4℃放置 5min；

6)12000r/min 离心1min。转移上清至新的 2mL离心管，加入200μL Buffer HB 混匀，4℃放置 5min。

7)12000r/min 离心 1min。转移上清至新的 2mL 离心管，加入 200μL Buffer GF 颠倒混匀。

8)取上一步所得溶液700μL加入到一个吸附柱CB3中，12000r/min离心30s， 倒掉废液，将剩余溶液均离心完。

9)向吸附柱 CB3 中加入 500μL 漂洗液 PWS，12000r/min 离心 30s，倒掉废 液。

10)向吸附柱 CB3 中加入 500μL70%乙醇，12000r/min 离心 30s，倒掉废液。

11)12000r/min 离心 2min，倒掉废液。

12)将吸附柱 CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗 液。将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-100μL 洗脱 Buffer TE，室温放置 2-5min，12000r/min 离心 2min，将溶液收集 到离心管中。提取的 DNA 经 NanoDrop2000 仪定量分析并检测质量后使用。

4.高通量测序

4.1交由相应生物处理公司进行高通量的测序

4.2对测序结果进行分析。

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1、2022年3月1日～2022年3月14日，接受任务、查阅和翻译文献，撰写开题报告；

2、2022年3月15日～2022年3月28日，完成实验前准备工作，配制各实验所需品；

3、2022年3月29日～2022年4月11日，预实验，菌种活化、培养；

4、2022年4月12日～2022年5月9日，样品总DNA提取；

5、2022年5月10日～2022年5月23日，分析高通量测序数据，统计分析；

6、2022年5月24日～2022年6月9日，完成论文撰写工作与答辩。