1. 研究目的与意义
研究背景
铜污染是随着现代工业的发展逐渐引起重视的，铜矿的开采和冶炼、金属加工、机械制造等是铜的 主要污染源，造成环境中铜含量显著增加。含铜废水灌溉农田会使铜在土壤和植物中累积，进而危害人类 健康。铜对水生生物的毒性也很大，曾发生铜污染引起牡蛎肉变绿的事件，因此治理铜污染迫在眉 睫。传统的修复方法像植物修复、污染物化学浸出法、毒性金属耐受性细菌的生物修复等费用昂贵且不能 长期成功，其他方法虽效果很快但很昂贵且会摧毁土壤的生产力或对水环境易造成二次污染等。
微生物诱导碳酸盐沉淀（micp）可用于固定土壤和水体中的重金属铜，重金属铜主要以共沉淀的形式被固定，土壤和水体中的重金属分别为阴阳离子型重金属会以类质同象置换的方式分别占据方解石中的碳酸根离子和钙离子位，从而促使污染土壤中的可交换态重金属向碳酸盐结合态转移.。微生物诱导碳酸盐沉淀是解决铜污染的一种新型、环境友好的绿色方法。本文考察了巴氏芽孢杆菌对铜离子的耐受性并初步观察其诱导的铜沉淀的形态变化，以期该方法可以更好地应用于废水中重金属铜的处理。
2. 研究内容和预期目标
研究内容
（1）考察正常培养条件下，巴氏芽孢杆菌的生长情况；
（2）考察不同铜离子浓度条件下，巴氏芽孢杆菌的生长情况：液体振荡培养法和平板菌落法；筛选出最低抑菌浓度；
3. 研究的方法与步骤
研究方法
通过测定巴氏芽孢杆菌菌液在0，2，4，6，8，10，12，14，24，36，48h时的OD600，通过Excel绘制巴氏芽孢杆菌的生长曲线。添加不同铜浓度梯度的溶液后每4h测定菌液OD600、pH值，共72h。测完后通过Excel对整理好的实验数据绘制巴氏芽孢杆菌在铜不同浓度下的生长曲线图、72h的pH变化折线图。利用平板菌落计数法分别测定每个样品在不同铜浓度梯度下最终的活菌数，通过Excel绘制活菌数折线图。最后结果分析并筛选出最低抑菌浓度。
实验步骤
一、巴氏芽孢杆菌生长曲线
（1）将存于-80℃低温冰箱中的巴氏芽孢杆菌冻存液取出，用枪头沾取少量细菌冻存液均匀划线接种到YE-urea固体平板上，恒温培养箱30℃培养24小时。固体平板上有明显的巴氏芽孢杆菌单菌落后取出。挑取单菌落加入两个5 mL NB-urea液体培养基的试管中，恒温震荡培养箱中培养（30℃,180rmp）14小时；
（2）14小时后取6ml菌液离心（6000rmp,5min）后吸去上清液，加入3mlNB-urea液体培养基浓缩混匀，测其OD600并调至1左右。取50ulOD600=1的菌液加入各5 mL NB-urea液体培养基的试管中，恒温震荡培养箱中培养（30℃,180rmp）48h并测OD600，平行试验3组。（0，2，4，6，8，10，12，14，16，24，28，32，36，48）；
二、巴氏芽孢杆菌对重金属铜的耐受性试验
1.生长曲线
制备1M的CuCl2溶液，设置重金属铜浓度梯度（5，10，15，20，25mM）
|
| 5mM | 10mM | 15mM | 20mM | 25mM |
| CuCl2体积 | 25ul | 50ul | 75ul | 100ul | 125ul |
| NB-urea | 4975ul | 4950ul | 4925ul | 4900ul | 4875ul |
其他步骤同（一、巴氏芽孢杆菌生长曲线）。（0，8，12，16，20，24，32，36，40，44，48，56，60，64，68，72）
2. pH
每隔4h测完菌液OD600值后用pH仪测量菌液pH值。
3.重金属铜矿化的显微照片
每次测完OD值后用油镜观察沉淀形态变化，拍照片。
4. 活菌数
设置重金属铜浓度梯度（5，10，15，20，25mM）加到固体培养基。并用涂布棒涂布均匀，然后置于恒温培养箱内在30℃的温度下培养24 h。记录培养基上数目范围在3~100的菌落数并拍照。根据稀释倍数和取样体积计算每个样品最终的活菌数，单位为CFU/mL，平行试验3组。
三、整理汇总实验数据，绘制巴氏芽孢杆菌生长曲线图、巴氏芽孢杆菌在重金属铜不同浓度下的生长曲线图、72h的pH变化折线图、活菌数折线图并筛选出最低抑菌浓度；观察重金属铜沉淀形态变化；撰写论文并答辩。
4. 参考文献
[1] chung h, kim sh, nam k.inhibition of urea hydrolysis by free cu concentration of soil solution inmicrobially induced calcium carbonate precipitation[j]. sci total environ,2020, 740: 140194
[2] 王茂林, 吴世军, 杨永强, 陈繁荣. 微生物诱导碳酸盐沉淀及其在固定重金属领域的应用进展[j]. 环境科学研究, 2018, 31(2): 206-214.
[3] chen x, achal v. biostimulationof carbonate precipitation process in soil for copper immobilization[j].journal of hazardous materials, 2019, 368: 705-713.
5. 计划与进度安排
①2022年1月1月～2022年1月12日 查阅文献，确定课题内容框架，学习巴氏芽孢杆菌培养的基本操作。
②2022年3月1日～2022年3月14日 调研大量文献，完成开题报告。设计实验方案并完成预实验。
③2022年3月15日～2022年5月20日 考察正常培养条件下，巴氏芽孢杆菌的生长情况；考察不同铜离子浓度条件下，巴氏芽孢杆菌的生长情况及并对该菌诱导铜沉淀产物进行观察，进行数据处理完成论文主体容。
