氨基酸螯合镧处理下水稻mRNA差异表达谱研究开题报告

1. 研究目的与意义

1.1 重金属对植物的毒害作用水稻是我国主要的粮食作物，约90%的种植面积分布在亚洲，是东南亚国家最重要的食物来源[1]。因此，水稻的产量和品质一直受到人们的广泛关注。随着工业化的快速发展，土壤重金属污染因其易富集、难降解、分布广等特点已经成为日益严重的环境污染问题之一[2]。重金属进入土壤的方式主要有大气沉降、雨水冲刷、微生物的摄取转化。张小伟[3]在农田土壤重金属污染监测中指出，污灌及化工企业排污河水的侧渗是导致该农田土壤重金属超标的首要因素，化工企业降尘与农田土壤重金属污染也有耦合效应。重金属污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性[4]。随着重金属等污染物在土壤中不断富集，植物中的重金属必然会不断积累，进而通过食物链传到动物和人类体重，严重危害人体的健康。1.1.1 Pb对植物的毒害作用Pb的主要来源有人类工业生产活动中汽油燃烧产生的废气、采矿和冶炼、铸造及人类生活生产活动中的含Pb废水，含Pb杀虫剂、污泥作用在土壤上等。高浓度的Pb会阻碍植物生长，使植物的花期、抽穗期和成熟期推迟[5]。宋丽娜[6]在文献中指出，植物中铅主要集中在根部，地上部分受铅胁迫的危害要比地上部分小得多，用铅对植物处理4天后，地上部位与对照无明显差异，而根长抑制率达10%。水稻幼苗在含铅溶液中生长18天后，生物量随着铅浓度的增高而降低。铅可以引起细胞膜通透性的变化，若细胞膜被破坏，则会有更多的铅进入原生质体，从而对细胞内部产生更大的毒害作用。此外，铅还可以抑制叶绿素的合成。叶绿素存在于植物叶绿体片层膜系统中，是植物进行光合作用的重要组成部分。叶绿素吸收光子后，就进入不稳定的、高能状态的激发态，由激发态能量推动光化学反应进行。重金属还可进一步破坏植物膜系统，导致位于膜上的酶活性紊乱，同时影响叶绿素的合成，导致植物的光能利用率降低[7]。匡经舸[8]等人通过对铅胁迫下洋常春藤叶绿素进行测定，发现叶绿素 a、叶绿素 b 和总叶绿素含量在铅胁迫下均显著下降趋势。1.1.2 镉（Cd）对植物的毒害作用Cd是一种对动植物具有极强毒性的重金属，Cd 以高移动性、高毒性和污染面积最广的特点，而被列为主要重金属污染来源，尤其是在污灌区种植的小麦和水稻，其体内的重金属离子含量显著增加[9]。镉对植物的种子萌发、地上与地下部分（主要在根部）以及作物光合作用均有影响。Cd 胁迫对种子的影响主要体现在抑制发芽率、发芽势和发芽指数[10]。陈晶[11]在对玉米幼苗的研究中得出，玉米幼苗根系在 0.5 mg/L Cd 胁迫下变细变短，同时也抑制了地上部的生长。1.1.3 铜（Cu）对植物的毒害作用Cu是水稻生长所必须的微量金属元素，同时也是多种酶的重要辅因子，如抗坏血酸氧化酶、参与呼吸作用的细胞色素氧化酶等。Cu还在叶绿体质体蓝素中参与光合作用的电子传递过程[12]。尽管Cu对维持植物正常新陈代谢与生长发育具有重要意义，但植物对铜的需求量极其微小。随着各种Cu矿的过度开采和含Cu污水的排放、含Cu肥料及农药的使用，导致土壤中铜含量大大超标[13]。众多研究表明，过量的铜会影响作物种子的萌发率、减缓作物长势、抑制植物光合作用、诱发DNA断裂产生遗传毒性、降低作物生物量、诱发活性氧（ROS）的产生、抑制根系生长等，尽管不同的物种对Cu的耐受程度不同，但大多表现为先促进后抑制[12, 14]。1.2 稀土镧对植物的生理效应稀土元素是镧系元素和钪、铱两元素的统称[15]。稀土并不稀少，尤其我国是稀土大国，稀土资源位于世界首位。然而我国的稀土利用率很低，多用于工业以及出口，这也导致了国外的许多国家战略性从我国大量购入稀土，这也是我国对稀土进行管控的原因之一。稀土作为农用肥料取得了一定的研究进展。我国对于稀土农用的研究已有近50年的历史，最初只有单一稀土元素微肥，如氯化稀土REC13 ·6H2O和硝酸稀土RE(NO3)3·6H2O等。而现在通过与其他肥料和营养元素(钾、钙及其他微量元素)进行复配,研发出配比适宜的增效肥料[16]。适宜浓度的稀土元素对农作物有显著的增产效应，且对提高植物抗旱、抗寒、耐酸雨和耐重金属胁迫能力有一定的促进作用，并能较好地增强作物的抗逆性。与其他稀土元素相比，镧（La）在环境含量更高，常被用作稀土微肥的主要成分[17]。曹勇[18]在用镧处理镉污染的芥菜后发现，经稀土镧处理后，芥菜叶片叶绿素含量普遍高于空白对照组，且在120mg/kg内叶绿素含量随着镧浓度的增加而增加。原因可能是镧可以促进植物叶绿体蛋白的合成，从而延缓了植物叶绿体的衰老，提高叶绿素含量。苗永美[19]等人的研究表明，50μmol·L-1的 La3 能显著促进铁皮石斛茎段不定芽的分化及芽苗生长。研究还表明一定浓度的 La3 有利于多糖、黄酮、酚酸和联苄的合成，但超过110μmol·L-1时促进效果减弱。上述研究表明镧对于促进作物生长有一定的适用范围，而超过一定的范围后则会对作物造成损害。王振宇[20]分别用10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L稀土镧和铈处理山白兰的幼苗后发现低于40mg/L的镧和铈有利于提高山白兰苗高、地径增长，促进山白兰幼苗各器官生物量的积累，以20mg/L最佳且相同浓度下镧的促进效果要好于铈，而高于40mg/L则表现出抑制作用。研究还表明镧对山白兰地下部分氮、磷含量的提升高于地上部分，对幼苗吸收氮素能力的增强效果较强。可见，一定量的镧对金属胁迫下的水稻可能具有保护作用。1.4 作物转录组测序转录组( Transcriptome) 是指特定细胞或组织中的全部RNA转录产物，主要包括mRNA和非编码RNA[21]。近年来，随着转录组学和测序技术的快速发展，转录组测序分析已经广泛应用于农业、医学及生命科学等领域。转录组测序分析可以做到不依靠参考基因组，直接对转录本进行测序分析比较，研究各种基因的差异表达情况，从而发现并分离出潜在的优异基因，为作物育种提供丰富的基因资源。1.4.1 高通量测序 高通量测序( High-throughput sequencing)技术是指在一次运行中同时对数十万到数百万的 DNA 序列进行序列测定，且读长较短的技术，也被称为“下一代测序技术”，又称“深度测序”。高通量测序技术主要包括以Roche 454、Illumina Solexa 和 ABI SOLiD为测序平台的第二代测序技术及以 Pacbio 为测序平台的第三代单分子测序技术[22-24]。二代测序读长较短，需要从头组装且拼接过程较麻烦，一般只用于基因的局部结构测序。三代测序相比于二代读长更长且能实现实时测序，测序过程无需打断也没有模板的扩增过程，但光学信号要远弱于二代测序，容易产生非检测特异性的背景干扰，错误率较高，因此目前高通量测序还以二代测序为主[21]。1.4.2 转录组测序分析转录组测序分析(RNA-Seq)技术，是指利用高通量测序技术将细胞或组织中全部或部分mRNA、smallRNA 和 no-codingRNA进行测序分析的技术[25]。该技术速度快、准确性高且运行成本低。高通量测序技术使得植物中基因表达水平的大规模、高速鉴定得以实现。虽然目前在水稻中已有关于稀土缓解重金属胁迫的相关研究，但多集中于生理生化水平和单分子水平，且对于不同的研究结果重复性较低，稀土镧对于铜胁迫下水稻的生物学功能也尚未明确，在转录组水平系统地分析 La3 对 Cu2 胁迫应答中的调控特征更是鲜见报道。到目前为止，已有多项研究对水稻的转录组进行测序，并且其数据已经在NCBI的GEO数据库中上传，例如：Lim M,Hwang Y 通过对水稻转录组测序进行水稻萌发过程中糖，细胞能量和氧气的转录组调节比较，其登录号为GSE168915。Shanmugavadivel PS等人在高温胁迫下水稻小穗的转录组动力学的探究中，对基因（Nagina22），耐高温和耐旱的水稻品种IR64和热敏感的稻基因型8天热胁迫穗进行了微阵列分析，来便了解这两种基因型在热条件下的转录组动态并鉴定对调控水稻热胁迫耐受性重要的基因，其登录号为GSE136746。转录组测序还可用于作物的基因功能注释，将所测reads与已有数据库（如GO、KEGG）已注释功能的基因相比对分析，从而揭示特定转录状态下的基因的功能和生物通路等[26]。1.4.3 作物的重金属信号应答通路重金属离子会导致作物体内抗氧化酶的动态失衡，从而启动植物的抗氧化防御机制。重金属胁迫下作物的响应物质主要有叶绿素、多种抗氧化酶、丙二醛等。重金属胁迫会损伤细胞膜，使细胞膜的透性大大增加，还会产生多种活性氧从而导致膜脂过氧化。丙二醛是用于衡量细胞膜损伤的最常用指标，丙二醛作为膜脂过氧化的最终产物可以间接评价植物细胞膜的受损状况[27]。植物还会分泌用对重金属具有高亲和力的有机酸与重金属离子结合形成螯合物，具体可分为外部螯合与内部螯合两种。金属硫蛋白 (metallothionein，MT)具有金属结合能力及对过量金属离子解毒作用[28]。Jain [29]等发现在铬胁迫下MT基因在茎秆和叶片中表达量显著增加。1.5 研究目的及意义 在本课题的研究中，我们以水稻幼苗为研究对象，用CuSO4溶液模拟铜胁迫作为对照组（通过对不同浓度铜处理下水稻生理指标的测定来选出最适铜处理浓度），用氨基酸螯合镧处理铜胁迫水稻作为测试组，分别测定水稻的生理指标，并利用RNA-Seq转录组测序，寻找铜胁迫和螯合镧处理水稻中差异表达的mRNA。进一步将对照组和测试组中差异表达的基因映射到分子通路，力争发现镧调控水稻铜胁迫应答的功能和信号通路，这些通路若经过进一步的实验验证，将为提高水稻重金属胁迫的耐受性提供重要的信息。

2. 研究内容和预期目标

2.1 研究内容1. 进行水稻幼苗的培养和模拟铜胁迫溶液以及氨基酸螯合镧溶液的配制。

2. 对不同浓度铜胁迫下水稻幼苗的生长和生理指标进行测定和统计分析，找到最佳胁迫浓度，并将该浓度用于后续rna测序分析。

3. 将水稻分为铜胁迫组和镧处理组，分别取三个生物重复，提取总rna，并利用illumina hiseq 4000平台进行高通量转录组测序。

3. 研究的方法与步骤

3．本课题拟采用的研究方法、步骤1、采用硫酸铜模拟铜胁迫处理水稻，通过测定水稻sod、cat、pod、叶绿素等生理指标确定最适铜胁迫浓度2、不同浓度la（no3）3处理铜胁迫的水稻进行生理指标测定3、提取总rna，经dnase i处理后于1％琼脂糖电泳评估rna完整性，nanodrop 分光光度计分析 rna 纯度，使用 truseq stranded total rna 试剂盒创建 cdna 文库， agilent 2100 bioanalyzer 质检合格后在 illumina hiseq 4000 平台进行测序。

4、差异表达分析：利用 deseq 软件筛选差异表达基因，用负二项分布检验进行差异显 著性检验，显著表达基因筛选条件为 ：p 0.05，差异倍数 2， 且 fdr 0.05。

筛选出来的差异表达基因绘制火山图并对差异表达基因进行非监督层次聚类分析。

4. 参考文献

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5. 计划与进度安排

1、2022-03-05～2022-03-15 接受任务，按照指导教师要求查阅资料，撰写开题报告。

2、2022-03-16～2022-03-28 完成水稻幼苗的培养和模拟铜胁迫。

3、2022-03-29～2022-04-06 对不同浓度铜胁迫下水稻幼苗的生长和生理指标进行测定和统计分析。