1. 研究目的与意义
壳聚糖又名脱乙酰甲壳素、氨基葡萄糖，是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，化学名称为学名2-氨基-1,4-β葡聚糖。它是目前发现的唯一的一种天然的碱性多糖，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。
固定化酶技术是用物理或化学手段．将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术，是使生物酶得到广泛而有效利用的重要手段。与游离酶相比,固定化酶在保持经固定化的酶其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
在本实验当中，壳聚糖分子中存在的丰富羟基和氨基能够使其在进行化学反应的时候增加更多独特的性能，尤其是壳聚糖分子中丰富的氨基，与各种蛋白质的亲和力十分之高，这使得其成为了一种十分优秀的酶固定化载体。
2. 研究内容和预期目标
| 本论文研究主要内容如下： 技术要求：学会木聚糖酶水解反应操作、产物分析、壳聚糖固定化酶等 设计条件：木质纤维素是世界上分布较多的一种可再生资源，利用木质纤维素生产相应衍生物目前已得到世界各国的高度重视。其中木聚糖是木质纤维素的重要组成部分，利用木聚糖生产的木糖和低聚木糖在食品、医药及保健品领域有广泛应用。目前木糖及低聚木糖主要依靠游离酶水解来生产,但生产成本偏高。本研究通过天然高分子壳聚糖为载体对木聚糖酶进行固定化，考察并分析壳聚糖载体固定化酶对玉米芯中的木聚糖降解生产木糖和低聚木糖的效率，以降低木聚糖酶用量提高寿命。工作要求：分析游离木聚糖酶及壳聚糖固定化木聚糖酶对玉米芯中木聚糖降解的影响，分析壳聚糖固定化木聚糖酶的效率及使用寿命，以降低酶的用量。 一、 查阅文献，写出开题报告（第1-2周） 根据论文题目，查阅正式出版的中外学术期刊和专著，从中选择10篇以上参考文献（外文1-2篇或以上），认真阅读，深刻理解，综合分析，掌握其最新动态，参照论文设计任务书的研究内容，写出开题报告（包括文献综述、选题目的和意义、研究方案、计划进度、参考文献）。论文撰写的格式按照院统一标准。如参考文献要列出作者姓名、论文标题、发表刊物、时间、卷（期）及起止页码。在查阅的文献中选1篇外文（5000以上外文印刷字符、文献内容要结合本研究内容）全文翻译为中文。 二、 实验研究前期准备工作（2周前） 1、根据论文计划任务书，参阅参考文献制定具体的实验方案； 2、准备实验药品和器具，未使用过的仪器学会正确操作使用； 3、酶水解反应, 酶固定化的准备工作； 三、实验研究工作的实施（正式实验：1-12周完成） 根据任务内容一步步做实验，包括熟练掌握木聚糖酶水解玉米芯中木聚糖操作、产物分析、反应条件优化、壳聚糖固定化酶技术及后继水解操作等等。实验结果收集分析，部分实验需要拍照作为实验结果分析材料。 四、论文的撰写与答辩（13～16） 在完成论文全部实验后，对实验的全部数据进行整理、分析，使用计算机绘图或进行数据处理、数据分析、撰写研究论文（字数15000以上）。论文撰写格式和打印按照院统一标准（论文撰写格式包括中、外文摘要、目录、绪论、正文主体、结论、致谢、参考文献、附录等。附录内含外文文献的译文及原文、实验报告和原始数据等），最后进行毕业论文答辩。 |
3. 研究的方法与步骤
| 1.1实验材料 底物：8%玉米芯混合液 酶：EX2018 反应器：摇床
1.2实验步骤 a. 游离木聚糖酶水解 1.游离酶用量对木聚糖水解的影响
2.Ph对木聚糖水解的影响
3.温度对木聚糖水解的影响
4.取样用移液管枪头取样倒入EP管中，离心后用针筒把上清液过滤膜注射入另外的EP管中，待测吸光度分析；如不能及时测吸光度，则将EP保存于4℃冰箱。
b. 木聚糖酶固定化制备 1. 准确称取 1.5g 壳聚糖，溶于 50mL 2%的乙酸溶液中，制得 3%壳聚糖溶液。用注射器（6 号针头）将壳聚糖溶液注入 2%三聚磷酸钠溶液（p H=8.2）中，静置 3h。过滤，用蒸馏水冲洗除去多余的三聚磷酸钠，即得中性球状的壳聚糖载体。
2. 称取 10.0g 载体，加入 100mL5%戊二醛溶液（pH10.0），50 ℃活化 6h。活 化结束后，过滤，然后用蒸馏水冲洗至中性。称取2.0g活化后的载 体，加入 20m L 木聚糖酶溶液于 18℃进行固定化反应。反应 16h 之后过滤，将固定化酶和剩余的酶液分离，用乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗固定化酶数次，即得固定化木聚糖酶。
3. 配制10%的木聚糖酶溶液(即20mL配 2g)，用80目左右的滤纸滤去载体。
c. 固定化游离木聚糖酶水解 反应条件同游离酶
1.3产物分析 DNS法测定木糖含量 1.3.1试剂和器材 玉米芯水解过滤后的上清液；DNS试剂；紫外-可见分光光度计；分析天平 1.3.2DNS试剂配制 量取375ml去离子水，加热至微热后顺序加入5.00g3,5-二硝基水杨酸、8.00gNaOH、2.50g苯酚、2.50g亚硫酸钠和150.00g酒石酸钾钠，溶解后定容至500ml，棕色瓶中室温下暗处放置一周后使用。 1.3.3样品检测 |
4. 参考文献
| 1.Ming-qi Liu, Xian-jun Dai, Rong-fa Guan, Xin Xu, 2014.Immobilization ofAspergillus nigerxylanase A on Fe3O4-coated chitosanmagneticnanoparticles forxylooligosaccharide preparation. Catalysis Communications,55, 6–10. 2.SmaaliS,Remond C,O' Donohue M.Biocatalytic conver-sion of wheat branhydrolysateusing animmobilized GH43β-xylosidase[J].J Brore Technol,2009,100(1):338-344. 3.张剑,范芳,固定化木聚糖酶的比较[J].研究酿酒科技,2007,152(2):35-37. 4.Saha,B.C.2003.Hemicellulose bioconversion.Journal of industrial microbiologybiotechnology,30(5), 279-91. 5.Yang,B.,Dai,Z.,Ding,S.Y.,Wyman,C.E.2011.Enzymatichydrolysis of cellulosic biomass.Biofuels.2,421-449. 6.Dumitriu,S.,Chornet,E.,1997.Immobilizationof Xylanase in Chitosan-Xanthan Hydrogels.Biotechnol.Prog.13,539-545. 7.Driss,D.,Zouari-Ellouzi,S.,FatmaChaari,FatmaKallel,ImenGhazala,Bouaziz, F.,Raoudhaghorbel,SemiaEllouzChaabouni,2014.Production and in vitroevaluation of xylooligosaccharides generatedfromcorncobsusingimmobilized Penicillium occitanis xylanase.Journal of MolecularCatalysisB:Enzymatic. 102, 146–153. 8.Aragon,C.,Mateo,C.,Ruiz-Matute,A.I.,Corzo,N.,Fernandez-Lorente,G.,Sevillano,L., Díaz, M., Montie, R., Santamaría, R.I., Guisan, J.M. 2013. Production ofxylo-oligosaccharides by immobilized-stabilized derivatives of endo-xylanasefrom Streptomyces halstedii.Process Biochemistry.48,478–483. 9.夏文水,谭丽.壳聚糖固定化酶研究进展[J].食品与机械, 2007,23(6):7-10. |
5. 计划与进度安排
1、2022年12月25日-2022年3月1日 查阅文献，根据任务书书写开题报告，制定实验方案，翻译外文文献；
2、2022年3月2日-2022年3月10日准备酶水解反应材料，熟悉摇床操作；
3、2022年3月11日-2022年4月22日 酶水解反应、产物分析、合成有机高分载体固定化酶；
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