茉莉酸对盐胁迫小麦幼苗逆境指标的影响开题报告

1. 研究目的与意义

拒不完全统计，全世界盐碱地的面积为9.5438公顷，我国为9913万公顷。土壤盐渍化是世界范围内影响农业生产的主要非生物逆境之一。我国盐渍地约占可耕地面积的20%，近年来，由于不合理灌溉和耕作，农田发生次生盐渍化的现象不断加剧。盐碱环境是作物生长和产量提高的重要限制因子，主要影响作物的正常生长发育，并且对作物的光合作用有着严重的抑制作用，高盐碱环境也影响作物水分的吸收和细胞膜的通透性。

小麦是三大谷物之一，是世界上第二大粮食作物，仅次于玉米。因此,提高小麦等农作物对抵御盐渍化的抵御能力，对于改善盐分胁迫条件下植株的生长发育及产量具有重要的实践意义。

茉莉酸及其衍生物茉莉酸甲酯等统称为茉莉酸盐,是广泛存在于植物中的一种生长调节物质在调控植物发育和渗透胁迫应答等方面发挥着重要作用。作为一种重要的新型植物内源激素广泛参与调控植物防御反应和形态发育相关的多种生物学过程。

2. 研究内容和预期目标

本实验选择小麦苗期作为实验时段，研究不同茉莉酸浓度对小麦幼苗逆境指标的影响。主要方法是将小麦幼苗用蒸馏水浸种处理，再用不同浓度梯度的JA对小麦种子进行胁迫处理，以25℃下培养的小麦幼苗和经JA胁迫处理的小麦幼苗作为对照，测定小麦幼苗的以下生理指标：发芽率、相对电导率、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、叶绿素含量和脯氨酸（Pro）含量、叶片受损率，并作变化曲线，分析小麦幼苗JA逆境胁迫过程中的各项生长指标,为探讨提高小麦的抗逆性奠定基础。本实验力求客观反映小麦幼苗对JA处理后可能存在的剂量效应和时间效应。

3. 研究的方法与步骤

一、预实验

小麦种子用蒸馏水洗净，75%的乙醇消毒10min，在蒸馏水中浸种24h。挑选大小一致、饱满的250粒小麦种子，每50粒为一组，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，同时加入不同浓度的Nacl溶液，设置4个浓度梯度（0.7%、1.0%、1.3%、1.6%），对照组加等量的蒸馏水，每皿用量5ml，于25℃暗培养箱萌发，每天喷水一次，种子开始萌动后，每8h记录一次发芽数，7d后计算小麦的出芽率，找出最适胁迫浓度范围。

挑选大小一致小麦幼苗250棵，每50棵为一组，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，加入完全培养液，同时喷洒不同浓度的茉莉酸溶液，设置4个浓度梯度（3*10^-4，3*10^-3，3*10^-2，3*10^-1mmol/L），对照组喷洒等量的蒸馏水，每天光照14d，每天喷水一次，待小麦苗生长15d后测其电导率，找出最适处理浓度。

二、正式试验

小麦种子用蒸馏水洗净，75%的乙醇消毒10min，在蒸馏水中浸种24h。挑选大小一致、饱满的250粒小麦种子，每50粒为一组，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，分别加入不同浓度NaCl溶液，每个浓度设置4个实验组。以加蒸馏水的为空白对照，每皿用量5ml，于25℃暗培养箱萌发，每天喷水一次，种子开始萌动后，每8h记录一次发芽数，为每次记得的3个重复净发芽数之和。等种子发芽7d后（约长出两片叶子），以加NaCl溶液的四个浓度为对照，每个浓度设置三个平行实验。放在光照培养箱培养，加入一定量的完全培养液，叶面喷施茉莉酸溶液，对照组用等量的蒸馏水代替。完全培养液每三天加一次，保持相关处理，每天照光14h，初生芽于光下生长15d后，测定相关胁迫指标。

三、各项指标测定

1.植物超氧化物歧化酶活性的测定

① 主要试剂及仪器

试剂：甲醛标准储备液、甲醛标准使用液、乙酰丙酮溶液（体积比0.25%）

仪器：研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、微量移液枪、离心管、光照箱（光照度为4000lx）、指形玻璃管、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）

② 绘制甲醛标准工作曲线

③ 提取 ：取新鲜叶片洗净，称取5g，按1:1比例加入pH为7.2的0.05mo1/LTris^-盐酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆。4℃浸提1h，12000rpm离心30min取上清液。按1:1.5比例缓慢加入丙酮，边搅拌。4℃静置8h，12000rpm离心30min取沉淀，用适量的提取缓冲液溶解沉淀，50℃水浴加热15min，12000rpm离心30min取上清，即为酶粗提液。

④ 测定： 取五支试管 按下表操作 ，其中三只为测定管，两支为对照管，混匀后将一支对照管置于暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应15min，然后立即置于暗处终止反应，以避免光管作为空白参比调0，分别测定560nm处其他各管的吸光度。

2.MDA含量测定——硫代巴比妥酸法

① 主要试剂：10%三氯乙酸（TCA）、0.5%硫代巴比妥酸（TBA）、

② 仪器设备：研钵、恒温水浴锅、紫外分光光度计、离心机、电子天平、移液管

③ MDA的提取与显色：称取0.5g小麦幼苗叶片,加入1mL10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨，再加入4mL三氯乙酸充分研磨,将匀浆液转入离心管,加入5mlTBA沸水浴10min（自试管内出现小气泡计时），取出试管冷却，于3000r/min离心10min,取上清液并计算体积。吸取2mL提取液，加入2mL0.6%TBA液，混匀，以0.6%TBA液为对照，测定其在532nm、600nm和450nm处的OD值。

④ 结果计算：

⑤ MDA含量（μmol/L）=（MDA浓度μmol/L*提取液体积ml）/样品重量g*1000

⑥ 将结果记录于表中

3.叶绿素含量测定——用叶绿素计测定

① 叶绿素测定的整个实验过程中，需要用叶绿素计测定不同小麦叶片的同一片区域，本实验选择在距小麦幼苗叶尖2~3cm处测定。每个平行对照组选择不同的叶片测10~15次叶绿素含量，求平均值作为一个数据，每组做3个平行。

② 将结果记录于表中

4.脯氨酸（Pro）含量测定

① 主要设备：分光光度计，恒温水浴锅，漏斗，具塞刻度试管(20ml)，移液枪（1 ml和5 ml），5 ml和1 ml刻度试管，烧杯，吸水纸，玻璃棒，试管架，比色皿等。

② 主要试剂：3％磺基水杨酸溶液、2.5％酸性茚三酮显色液、脯氨酸标准溶液、甲苯

③ 脯氨酸提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.2g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，研磨提取，匀浆移至离心管中，沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后3000r/min离心10min，取上清液待测。

④ 标准曲线制作

（1）取7支具塞刻度试管按表2加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。

（2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520nm下比色。

（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。

⑤ 各吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520nm下比色）。

⑥ 结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度脯氨酸含量的百分数。

脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)]=(C·V)·(a·W)－1

式中：C一提取液中脯氨酸浓度，由标准曲线求得：

V－提取液总体积（ml）

A---测定时所吸取得体积（ml）

W-----样品重（g）

① 将结果记录于表中

5.可溶性糖含量的测定——蒽酮比色法

①标准曲线制作。

②可溶性糖提取：称取0.3g新鲜小麦叶片，剪碎混匀，放入具塞试管中，加入10ml蒸馏水，在沸水浴浸提30min，将提取液过滤入，再加入10ml蒸馏水，沸水浴浸提30min，提取液过滤入同一25ml容量瓶，最后漂洗，定容至刻度。

③显色：取0.5ml提取液，依次加入1.5ml蒸馏水，0.5ml蒽酮乙酸乙酯溶液和5ml浓硫酸，振荡后，立即沸水浴，逐管保温1min，自然冷却至室温，在630nm处测吸光度，记录数据。

④结果计算

最后通过标准曲线求出可溶性糖的含量（μg），按下方公式计算出被测小麦幼苗叶片的糖含量：

可溶性糖含量（%）=

公式中：C——标准曲线上求得的糖含量（μg）

V总——提取液总体积（ml）

V_测——吸取样品液的体积（ml）

N——稀释倍数

W——样品鲜重（g）

⑤将结果记录于表中

⑥结果分析

6.相对电导率的测定——电导仪法

① 仪器设备：电导率仪、真空泵（附真空干燥剂）、恒温水浴锅、水浴试管架、20ml具塞刻度试管、打孔器（或双面刀片）、10ml移液管（或定量加液器）、试管架、电炉、镊子、剪刀、搪瓷盘、记号笔、滤纸、塑料纱网（约3cm²）。

② 容器洗涤：所用容器用去离子水彻底清洗干净，倒置于洗净而垫有洁净滤纸的搪瓷盘中备用。水的电导率要求为1~2μS/cm。为了检查试管是否洁净，可向试管中加入1~2ml电导率在1~2μS/cm的新制去离子水，用电导率仪测定是否仍维持原电导率。

③ 材料处理：分别在正常生长和逆境胁迫的植株上取同一叶位的功能叶若干片。若没有逆境胁迫的植株，可取正常生长的植株叶片若干，分成2份，用纱布擦净表面灰尘。将一份放在-20℃左右的温度下冷冻20min（或置40℃左右的恒温箱中处理30min）进行逆境胁迫处理。另一份裹入潮湿的纱布中放置在室温下作对照。

④ 测定

（1）叶片用离子水冲洗2次，再用洁净滤纸吸净表面水分。用6~8mm的打孔器避开主脉打取叶圆片（或切割成大小一致的叶块），每组叶片打取叶圆片60片，分装在3支洁净的刻度试管中，每管放20片。

（2）在装有叶圆片的各试管中加入10ml的去离子水，并将大于试管口径的塑料纱网放入试管距离液面1cm处，以防止叶圆片在抽气时翻出试管。然后将试管放入真空干燥箱中用真空泵抽气10min（也可直接将叶圆片放入注射器内，吸取10ml的去离子水，堵住注射器口进行抽气）以抽出细胞间隙的空气，当缓缓放入空气时，水即渗入细胞间隙，叶片变成半透明状，沉入水下。将以上试管置20度下保持1h，期间要多次摇动试管，或者将试管放在振荡器上震荡1h。然后，用电导率仪测定处理和对照的初电导率（κ₁）。测完后，用记号笔记下试管中液面的高度，置沸水裕中10分钟。取出冷却至20℃，以蒸馏水补充蒸发掉的水分，并在20度下平衡20分钟，摇匀，测其终电导率（κ₂）。

⑤ 结果计算

相对电导率L=K_t-K₀/K_C-K₀

式中κt_————处理的电导率（μS/cm）；

κc_----—对照叶片的电导率（μS/cm）；

Κ0_----—蒸馏水的电导率（μS/cm）。

相对电导率的大小表示细胞膜受伤害的程度。

由于对照（在室温下）也有少量电解质外渗，故可按下式计算由于低温或高温胁迫而产生的电解质外渗，称为伤害度。

伤害度=(L_t-L_ck)/1- L_ck*100%

式中L_{t————}处理叶片的相对电导率；

L_ck——对照叶片的相对电导率。

7.可溶性蛋白含量测定——考马斯亮蓝染色法

① 主要试剂：考马斯亮蓝溶液、95%乙醇、100 mg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液、0.05 mol/L，pH7.8磷酸、0.05M pH7.8磷酸

② 标准曲线绘制：取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

③ 样品测定：

（1）样品提取：取鲜样0.2—0.5g，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min离心10min，上清液备用。

（2） 吸取样品提取液1.0ml（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min带反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。

④ 蛋白质含量计算

可溶性蛋白含量（mg/g）=(CVT)/1000VS（mg/g）

C—查标准曲线值，mg；

VT—提取液总体积，ml；

WF—样品鲜重，g

VS—测定时加样量，ml。

8.出芽率计算

9.叶片受损率（%）= 植株受伤害叶片( 焦边、褐色斑点、萎蔫、枯死) 数量/ 植株叶片总数量 *100%；

4. 参考文献

[1] 孙永媛,肖 凯,王冬梅等.不同小麦品种苗期的耐盐性鉴定及其相关生理参数研究[j].河北农业大学学报,2010,33（6）:84-90

[2] 李彩虹,张维军,王毅,等. 盐胁迫条件下钙对春小麦的生理效应[j]. 宁夏农林科技,2010,(6):21-22.

[3] 张士功,高吉寅,宋景芝.水杨酸、阿斯匹林对盐分胁迫条件下小麦幼苗体内na 、k 和cl^-的含量及其分布的影响[j].北京农业科学,1998,16(5):1-5.

5. 计划与进度安排

1、2017-12-25 确定选题；

2、2022-03-05 — 2022-03-18 接受任务，完成开题准备，上交开题报告；

3、2022-03-05 — 2022-04-13 开始实验工作的准备，进行预实验；确定实验方法；