灵芝Lac基因的生物信息学解析开题报告

1．本课题研究的背景、目的及意义

1.1 研究背景

漆酶(laccaseEC 1.10.3.2)是一种含Cu的多酚氧化酶,自从1883年日本学者吉田首次从漆树汁液中发现以来,漆酶特别是真菌漆酶一直是生物学、化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点, 漆酶作为广泛存在于植物中的含铜离子的氧化酶, 不仅参与了植物木质素的形成，还能够降解有毒物质,在纸浆的生物漂白,有毒污染物的降解等方面有较大的应用价值，因此受到越来越多的关注。

漆酶是一种很有应用潜力的多酚氧化酶,绝大多数为单体糖蛋白,能催化氧化多种酚类化合物。真菌漆酶能选择性催化木质素降解的特性可应用于纸浆漂白,Record等报道,漆酶和木聚糖酶组合处理纸浆,可以使最大幅度地降低其卡伯值,使其白度增高,并能降低能耗和减少环境污染。

灵芝漆酶基因目前在染料脱色方面有涉及，然而还有更多的用途我们并没有发现，通过构建进化树、氨基酸序列分析、蛋白质结构分析及蛋白亚细胞定位可以为后续研究灵芝漆酶基因的作用提供理论基础。

1.2 研究目的与意义

本研究以EST的电子克隆方法所获得的灵芝（Ganoderma lucidum）漆酶（GlLAC）基因序列为基础，分析GlLAC同源基因保守区，在DNAMAN中进行聚类分析，构建进化树。根据GlLAC基因序列翻译成氨基酸序列，分析该肽段特征、蛋白结构、蛋白质结构域、模体位置，并进一步分析其可能的亚细胞定位。进行亲/疏水性分析，判断其产物是否属于可溶性蛋白。形成二硫键分析，以判断该蛋白有形成高级结构的能力。分析该基因的蛋白亚细胞定位和蛋白质功能分类。这对于进一步了解灵芝（Ganoderma lucidum）漆酶（GlLAC）基因的作用，为后续功能研究提供基础的资料。

2．本课题主要研究内容和预期目标

2.1 主要研究内容

2.1.1 灵芝漆酶GlLAC基因与蛋白序列的同源性分析

以灵芝（Ganoderma lucidum）漆酶（GlLAC）基因种子序列为基础，将GlLAC基因与蛋白序列和其他物种的同源基因序列在DNAMAN中进行聚类分析，构建进化树。

2.1.2 灵芝漆酶GlLAC基因编码氨基酸序列分析

通过NCBI的ORFFinder功能将GlLAC基因序列翻译成氨基酸序列，用DNAStar的Protein分析该肽段分子量、极性氨基酸含量（包括酸性氨基酸和碱性氨基酸百分比等）、疏水性氨基酸比例、等电点等特征。利用Garnier-Robson法分析蛋白结构。

2.1.3 灵芝漆酶GlLAC基因编码蛋白的结构域和模体分析

利用NPS（NetworkProtein Analyis）提供的Proscan工具，分析蛋白质结构域、模体位置，并进一步分析其可能的亚细胞定位。

2.1.4 灵芝漆酶GlLAC基因编码蛋白的亲疏水性分析

通过在线的亲/疏水性分析（http://cn.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl），获得GlLAC基因的部分肽链的亲/疏水性分布曲线，以分析基因产物是否存在较大范围的亲水区，以此判断其产物是否属于可溶性蛋白。

2.1.5 灵芝漆酶GlLAC基因蛋白亚细胞定位和、二硫键预测与二级结构分析

利用DISULFIND对蛋白的氨基酸序列进行可能形成二硫键分析，以判断该蛋白有形成高级结构的能力。利用Expasy 提供的PROF软件进一步分析该基因的蛋白亚细胞定位和蛋白质功能分类。

2.2 预期目标：

通过电子克隆的方式获取完整的灵芝（Ganodermalucidum）漆酶（GlLAC）基因，并构建进化树。再通过得到的基因序列转化为氨基酸序列及灵芝漆酶GlLAC基因编码蛋白并对其进行分析，由此进一步分析该基因的蛋白质的性质及功能。

3．本课题拟采用的研究方法、步骤

本次课题拟定采用的方法和步骤如下：

3.1 灵芝漆酶GlLAC基因与蛋白序列的同源性分析；

方法：利用在线的http://www.ncbi.nlm.nih.gov/conserved domain，分析GlLAC同源基因保守区。将GlLAC基因与蛋白序列和其他物种的同源基因序列在DNAMAN中进行聚类分析，构建进化树。

步骤：

①通过NCBI比对分析，确定并分析GlLAC同源基因保守区序列。

②通过GlLAC基因与蛋白序列和其他物种的同源基因序列在DNAMAN中进行聚类分析，构建进化树。

3.2 灵芝漆酶GlLAC基因编码氨基酸序列分析；

方法：通过NCBI将GlLAC基因序列翻译成氨基酸序列，用DNAStar的Protein分析该肽段分子量、极性氨基酸含量（包括酸性氨基酸和碱性氨基酸百分比等）、疏水性氨基酸比例、等电点等特征。利用Garnier-Robson法分析蛋白结构。

步骤：

①通过NCBI的ORF Finder功能将GlLAC基因序列翻译成氨基酸序列，

②用DNAStar的Protein分析该氨基酸序列肽段分子量、极性氨基酸含量（包括酸性氨基酸和碱性氨基酸百分比等）、疏水性氨基酸比例、等电点等特征。

③利用Garnier-Robson法分析氨基酸序列蛋白结构

3.3 灵芝漆酶GlLAC基因编码蛋白的结构域和模体分析；

方法：利用NPS（Network ProteinAnalyis）提供的Proscan工具，分析蛋白质结构域、模体位置，并进一步分析其可能的亚细胞定位。

步骤：

①利用NPS提供的Proscan工具，分析灵芝漆酶蛋白质结构域、模体位置，并进一步分析其可能的亚细胞定位

3.4 灵芝漆酶GlLAC基因编码蛋白的亲疏水性分析；

方法：通过在线的亲/疏水性分析，获得GlLAC基因的部分肽链的亲/疏水性分布曲线，以分析基因产物是否存在较大范围的亲水区，以此判断其产物是否属于可溶性蛋白。

步骤：

①运用在线软件 (http://web.expasy.org/protparam/) 对灵芝漆酶蛋白质进行分析。

②采用Kyte Doittle标度计算，得到亲/疏水信号图，对其中峰值的分布规律进行分析，如果中峰值分布在-0.5 以下的比分布在0.5 以上的多，则表明该蛋白为亲水性蛋白。

3.5 灵芝漆酶GlLAC基因蛋白亚细胞定位和、二硫键预测与二级结构分析

方法：利用DISULFIND对蛋白的氨基酸序列进行可能形成二硫键分析，以判断该蛋白有形成高级结构的能力。利用Expasy 提供的PROF软件对GlLAC编码的肽链二级结构进行预测，包括α-螺旋和β-折叠的数目等。进一步分析该基因的蛋白亚细胞定位和蛋白质功能分类。

步骤：

①利用DISULFIND对蛋白的氨基酸序列进行可能形成二硫键分析，以判断该蛋白有形成高级结构的能力。

②利用Expasy 提供的PROF软件对GlLAC编码的肽链二级结构进行预测，判断其二级结构原件: a螺旋、不规则盘绕、β转角、延伸链，无规则卷曲的各个数目及其所占百分比等。

③进一步分析该基因的蛋白亚细胞定位，通过蛋白质的亚细胞定位可以反映对应基因的情况，使用PSPORT 程序预测可能分布的位置，如细胞核，线粒体基质或者是微体。蛋白质的分布位置也将决定功能，进而知晓蛋白质功能分类。

4．本课题主要参考文献

[1] 李惠敏, 罗琼, 肖君,等. 沙田柚RING-H2 finger基因的生物信息学分析[J]. 生物信息学, 2017,15(3):149-155.

[2] 曹先爽, 王进, 张瑶瑶,等. 香樟MK基因的克隆与生物信息学分析[J]. 热带作物学报, 2017(12).

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[4]Xiao X W, Zhu Q L, Liu H F, et al. Cloning,Bioinformatics Analysis andExpression Characteristic of Shikimate/Quinate Hydroxycinnamoyl TransferaseGene(GhHCT) in Cotton(Gossypium hirsutum L.)[J]. Journal of AgriculturalBiotechnology, 2014, 22(5):572-579.

[5]Wang X L , Li X B . Ezike T C , Linus E A , Udeh J , et al. Purification andcharacterisation of new laccase from Trametes polyzona WRF03[J].Biotechnology Reports, 2020, 28.

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[7] 李旭娟, 刘洪博, 林秀琴, et al. 甘蔗, KNOX 基因( Sckn1 )的电子克隆及生物信息学分析[J]. 基因组学与应用生物学, 2015,4(1):136-142.

[8] 李惠敏, 罗琼, 肖君,等. 沙田柚RING-H2 finger基因的生物信息学分析[J]. 生物信息学, 2017,15(3):149-155.

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[10]Yu K, Ang K S, Lee D Y. Synthetic Gene Design Using Codon OptimizationOn-Line (COOL).[J]. Methods Mol Biol. 2017:13-34.

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[12]张银波,江木兰,胡小加,张桂敏,马立新.灵芝(Ganoderma lucidum)漆酶基因的克隆及其序列分析[J].中国生物化学与分子生物学报,2005(05):699-703.

[13]方金涛. 灵芝漆酶的功能表达及其在工业废水脱色处理中的应用[D].南阳师范学院,2015.

5．本课题的具体进度安排（包括序号、起迄日期、工作内容）

（1）2022年11月30日至2022年12月25日：

与指导老师见面，讨论，确定论文选题；

（2）2022年12月28日至2022年2月26日（第1周前）：

接受毕业论文任务书；查阅文献资料；

（3）2022年3月1日至2022年3月12日（第1周~第2周）：

撰写开题报告，完成开题；完成外文文献选题；

（4）2022年3月15日至2022年4月9日（第3周~第6周）：

熟悉相关生物信息学分析方法与数据处理方法；并对不同的方法进行对比分析，及时调整分析方案；

（5）2022年4月12日至2022年5月7日（第7周~第10周）：

完成全部生物信息学分析，对研究结果进行总结和绘制图表；提交外文翻译；

（6）2022年5月10日至2022年5月28日（第11周~第13周）：

整理数据，根据基因特性深入分析，撰写论文初稿；

（7）2022年5月31日至2022年6月11日（第14周~第15周）：

提交数据和图表，毕业论文修改、定稿与毕业答辩